ATP 生物発光アッセイ

Cell Biology

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Summary

ホタルのルシフェラーゼ酵素オキシルシフェリンにルシフェリンと呼ばれる化合物を変換し、光や「発光」結果として生成されます。この反応には、研究者は、細胞内 ATP 量を測定するためルシフェリン-ルシフェラーゼ相互作用を悪用しているので、進めるにあたって、ATP から派生したエネルギーが必要です。細胞のエネルギー通貨 ATP の役割を与え、生物発光 atp は細胞の代謝と細胞の全体的な健康への洞察力を提供できます。

このビデオでは、ゼウスは、細胞呼吸、ATP の生産での糖代謝の結果を具体的に見直しについてを説明します。これは発光 atp とこの手法の一般化されたプロトコルの背後にある原理が続きます。最後に、どのように研究者現在使用している atp 生物発光実験条件の様々 な細胞生存率を評価するための調査。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学の必需品. ATP 生物発光アッセイ. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

生物発光 atp は、ATP のレベルを定量化し、生活、代謝活性の高い細胞を検出するために使用する一般的な手法です。ATP やアデノシン三リン酸はすべての生きている有機体のエネルギーの主要なソースとで「すべての」我々 はすべてを意味します。細胞レベルで細胞呼吸と呼ばれる代謝過程のセットを介して ATP が生成されます。

今日では、細胞呼吸に関与する経路について簡単に説明します。次に、atp 生物発光原理を紹介し、このメソッドを実行するための手順を追ってプロトコルを通過します。最後に、科学者が彼らの現在の研究ではこの手法を適用する方法を見ていきます。

細胞呼吸を導入し始めることができます。この現象はいくつかの代謝過程を伴いますが、糖代謝に対処するものに焦点を合わせます。

細胞質で解糖経路はグルコースをピルビン酸に変換し、プロセスで 2 つの ATP 分子を生成します。ピルビン酸はアセチル補酵素 A に変換されます、ミトコンドリアの中に運ばれ、また二酸化炭素を生成するプロセス。ミトコンドリア、トリカルボン酸または TCA サイクル、中に炭酸ガスが再度生成される、次に入るアセチル補酵素でとして NADH と FADH2 の高エネルギー分子であります。これらの分子最終的に「キャリー」電子電子輸送チェーン等に。

など、内電子は酸素を水に変換する前に、内部のミトコンドリア膜の異なるタンパク質複合体間順番に転送されます。このプロセス中には、陽子は、ミトコンドリアの膜間腔に「励起」が。これらのプロトンはミトコンドリアのマトリックスに戻って入力 ATP 合成酵素と呼ばれる蛋白質を通過するとき場合、ATP が実際に生成されます。一緒に、tca と等結果 36 ATP 分子の合成。脂肪やタンパク質などの他の栄養分子の内訳は、TCA サイクル、ATP の生産につながるなどに食べることができます。

今、我々 は、細胞が ATP を生成する方法を知って、この分子の細胞内濃度を測定に用いられる ATP 生物発光アッセイの原理について学びましょう。

構造的に、ATP はアデニン基盤、リボース砂糖および 3 つのリン酸基、後者が高エネルギー結合によって接続されています。これらの債券は、壊れたときのエネルギーを放出し、発光 atp がこのエネルギーを活用します。

基本的には、このアッセイは、ホタルのような「輝く」有機体から得られる化合物のルシフェリンを必要とし、その対応する触媒の酵素をルシフェラーゼと。酸素の存在下で、ルシフェラーゼは ATP からエネルギーを派生し、オキシルシフェリンにルシフェリンを変換します。この反応の副産物は ATP から得られる 2 つのリン酸基であるピロリン酸-アデノシン一リン酸やアンプに変換する-二酸化炭素と光や発光。発光はルミノ メーター、発光を定量化する機械で読み取られます。発光生産量は ATP の量に直接比例して、これはセル実行可能性および代謝の良い指標を提供しています。

今では生物発光 atp の背後にある原理を理解すると、一般的なプロトコルを紹介しましょう。

まず、細胞が培地を含む 96 ウェル プレートでシードされます。セルを 3 通、密度に依存した変動を考慮して様々 な密度でめっき。最も外側の井戸はすべての 4 つの側面に他の井戸で囲まれていない、これらの井戸の温度と蒸発率変数可能性があります。したがって、細胞外の井戸にメッキパーツをしない、代わりに、彼らは反応に影響を与える可能性がありますプレート全体の蒸発および温度の変動を避けるために水で満ちています。プレートは、細胞は培養皿に準拠するために 37 ° C でそれから夜通し孵化します。

次に、メディアを削除すると、ルシフェラーゼ、ルシフェリンが追加されますを各ウェルとプレートが 5-15 分間反応を促進するのにシェーカーに配置されます。次に、各ウェルからの混合物の部分は白 96 ウェル プレートに転送されます。彼らより正確な発光計測を可能にする上向きの光を反映して白プレート、よく使用されます。さらに、泡は避けてください、彼らは以降の解析を妨げる可能性があります。発光信号は時間の経過とともに減少し、約 10-12 分、ルミノ プレートは読んでください。

ルミノ結果の分析、平均発光値が同じセル密度と井戸から計算されます。この方法で健康的な制御サンプルと扱われた細胞から採取した発光データを比較すると、研究者は、特定の治療の生存率および代謝に及ぼす影響を評価、実験群で低下の発光を捜すことによって具体的には。

今では ATP 生物発光アッセイを実行する方法を見てきた、その研究の応用を説明しましょう。

科学者は、常に宿主細胞を殺すまたは害をしない新しい抗ウイルス剤を開発しようとしています。本研究では哺乳類細胞 multiwell プレートでシード, 特定のウイルスに感染している.各種抗ウイルス化合物は、これらのサンプルに追加された、効果的な濃度 50 または EC50 計算するログ濃度反応曲線が生成されました。EC50 化合物の細胞生存率は 50% の濃度であります。これは、化合物の細胞毒性を評価するために一般的に使用されるパラメーターです。

ATP レベルも様々 な条件の下でミトコンドリアの活動についての手がかりを得ることができます。ここでは、発光 atp はミトコンドリアに由来する齧歯動物の肝臓と、筋肉細胞の正常なティッシュのミトコンドリア機能の程度を評価する研究者を助けたの準備で実行されました。重要なは、病気の状態でミトコンドリアの機能を検査する方法を提供するためにこのプロトコルを拡張することができます。

科学者たちはまた、生体内におけるがん治療の可能性を調査するこの試金を使用してください。この例では、ひと腫瘍細胞は特急のルシフェラーゼに変更され、生きているマウスの脳に注入します。腫瘍細胞は、これらの動物の設立となり後、彼らは抗癌性の薬剤と扱われました。その後体内の ATP 生物発光アッセイでは、薬剤にさらされたマウスの腫瘍細胞が下位の ATP レベルを持っていたことを明らかにしました。

ゼウスの発光 atp 入門を見てきただけ。細胞呼吸経路とこれらの経路の最終製品である ATP を測定に使用するプロトコルに精通している必要がありますできます。ATP 生物発光アッセイでは、細胞の代謝や生存率に及ぼす生理学的・病理学的因子の研究に興味がある細胞生物学者の機能優秀なスクリーニング ツールとしてを作成します。いつも見てくれてありがとう!

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