检测活性氧物种

Cell Biology

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Summary

活性氧物种的化学活性,氧分子能够氧化其他分子。由于其无功的性质,有许多有害的影响,与未选中的 ros,包括 DNA 和其他生物分子的结构损伤相关联。但是,ROS 也可以调解人的生理信号。还有越来越多的证据,ROS 在一切从激活的转录因子对炎症杀死外来病原体的毒性的调解中发挥的重要作用,保护身体。

在这个视频中,我们将深入 ROS、 代谢和疾病之间的关联。 建立后他们的意义,我们将讨论的原则和一项议定书的测量细胞活性氧水平的常用方法: 使用非荧光探针,成为后氧化荧光。最后,我们会检讨一些当前的应用程序的这一技术在细胞生物学的研究。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 检测活性氧物种. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

在细胞内产生的活性氧物种有牵连的组织稳态、 细胞老化和像癌症这样的疾病状态。顾名思义,这些分子产生的氧气,作为稳定,分子氧分子自然存在,因为成对出现,它的电子。另外一个不成对的电子呈现不稳定的并且导致的超氧阴离子的形成 — — 一种活性氧或活性氧。除了超氧阴离子,还有几种类型的活性物种含不成对电子,该单元格的目的是要严格控制其水平。

在本视频中,我们将学习如何活性氧物种相关细胞代谢和疾病,探索背后测定其检测使用荧光探针,和我们去结束这种测定方法的广义协议的原则。最后,我们会探讨如何科学家正在实施这种方法在实验中今天。

首先,让我们讨论一下如何活性氧物种的产生,并考虑他们在细胞代谢和疾病的影响。

细胞内活性氧物种的一个重要来源是线粒体。通常情况下,在细胞代谢电子被运输通过一连串的蛋白质复合体,最终导致对水的分子氧的还原和同时代的 ATP。尽管这一进程的非同寻常调节,电子泄漏出来,超氧阴离子形成。

超氧阴离子的存在很快引起了其他形式的活性氧物种,如过氧化氢和羟自由基。这些激进分子,其中所有具有高活性的未成对的电子,可以氧化损伤细胞膜、 DNA 和蛋白质。为了抵消,细胞维持自身抗氧化剂储存的酵素象超氧化物歧化酶或如维生素 C、 减少自由基的分子。这个防御系统中的任何不平衡会导致潜在的致命性的积极反馈回路,从而造成过多的活性氧物种称为氧化应激的条件。

活性氧物种有牵连在启动和进展的癌症。这些分子的另一有害影响是老化的细胞,也被称为衰老的感应。"自由基理论的老龄化",提出了在正常的新陈代谢过程中在细胞内产生的活性氧物种唤起细胞衰老和死亡。

直到现在,我们讨论了这些高活性的分子,消极的方面,但是他们有积极作用的细胞生理学以及。在免疫应答过程中当吞噬细胞吞噬病原体,细胞装入"呼吸爆发"期间哪些过量的活性氧生成氧化降解病原体。此外,他们必要的中间体和各种规格的细胞信号通路,监管机构也可以甚至信号已经癌变的细胞的死亡。

为了量化这些有影响力的细胞氧化剂,科学家利用氧化后变成荧光的分子。常用的探针来检测活性氧物种是 H2DCFDA 或二氯-二氢-荧光素二乙酸酯,荧光素无荧光模拟。添加到单元格时,其细胞渗透性质允许它在被动扩散。

然后,细胞内酯酶催化水解反应,结果在塔斯马尼亚的乙酸酯组生物。这使得化合物极性更强,所以,它保留在细胞内。经氧化,通过广泛的活性氧物种包括氢原子的移除,非荧光 H2DCFDA 转换为高度荧光二氯荧光素或现金流量折现。这可以读取和通过板阅读器、 流式细胞仪或荧光显微镜来量化。

现在,你知道这种测定方法的工作方式,让我们看看它如何在实验室环境中进行。

通过转移细胞生长培养基中的磷酸盐缓冲液,开始跟着离心洗它们。除去上清,并添加荧光探针 H2DCFDA 解决方案。孵育染料加载在黑暗中,防止光漂白。孵化后洗要删除卸载的染料和转移细胞板的单元格。在这一点上,可以添加实验的氧化应激诱导剂。

当准备好分析时,细胞可以插入板读卡器。激发和发射波长荧光素为设置。板读完之后,可以分析值。结果表明样品在特定的时间点之间的活性氧物种的相对量。

现在,我们研究了实际的协议,让我们看怎么它被运用在实验中今天。

研究人员通常使用此方法探讨力学的吞噬功能。这组科学家想要研究斑马鱼在不同发展阶段的装载免疫反应的能力。如前所述,吞噬结果在一代的高活性氧物种或"呼吸爆发",那用来杀死病原体。由于酶 NADPH 氧化酶是重要的 ROS 生产者在巨噬细胞,这些科学家诱导,治疗与 NADPH 诱导斑马鱼爆破响应。结果表明,各个斑马鱼胚胎引发的"突发"的回应,那些在 72 小时后受精较高活性氧物种发展比那些在 48 小时后受精。

线粒体功能障碍增加活性氧物种是许多疾病的病理特征。因此,研究人员可以通过测量的氧化应激水平确定线粒体功能障碍。在这里,科学家们在神经元,加载 H2DCFDA,然后装上荧光显微镜样品。另外像过氧化氢氧化应激,细胞体荧光,这可能是相对值的线粒体功能障碍在显示突然增加。

星形胶质细胞被认为中枢神经系统神经元免受氧化应激。由于这个意义上,这些研究人员旨在发展测定检测中星形胶质细胞在外部诱导的氧化应激。他们这样做是通过孵化星形胶质细胞与过氧化氢和活性氧物种检测的荧光探针。采用流式细胞仪分析了随后荧光生成。星形胶质细胞氧化应激激活观察下降转移到右边增加的荧光强度,见过的区域内。

你刚看了朱庇特的视频检测活性氧物种或活性氧。综上所述,在这个视频中,我们讨论了活性氧、 细胞代谢与疾病之间的联系。然后,我们研究的原则和程序的活性氧物种检测方法。最后,我们探讨了如何研究人员正在应用此方法对他们进行调查。活性氧物种的仍然神秘角色分析具有极大的兴趣,对细胞生物学家,和可靠的测量荧光探针与被证明非常宝贵。一如既往,感谢您收看 !

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