Detección de especies reactivas de oxígeno

Cell Biology

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Summary

Especies reactivas del oxígeno son moléculas químicamente activas, derivados de oxígeno capaces de oxidar otras moléculas. Debido a su naturaleza reactiva, hay muchos efectos deletéreos asociados a la producción de ROS, incluyendo daño estructural para el ADN y otras moléculas biológicas. Sin embargo, ROS puede ser también mediadores de señales fisiológicas. Hay acumulando pruebas que ROS desempeñan un papel importante en todo, desde la activación de factores de transcripción a la mediación de toxicidad inflamatoria que mata patógenos extranjeros y defender el cuerpo.

En este video ahondamos en las asociaciones entre el ROS, el metabolismo y la enfermedad. Después de establecer su significado, vamos a discutir los principios y un protocolo de una metodología comúnmente utilizada para medir los niveles de ROS en las células: el uso de fluorescentes no sondas que fluorescente sobre la oxidación. Por último, vamos a revisar algunas aplicaciones actuales de esta técnica en investigación de Biología de la célula.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología celular. Detección de especies reactivas de oxígeno. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Especies reactivas del oxígeno producidas en las células han sido implicadas en la homeostasis del tejido, el envejecimiento celular y Estados de la enfermedad como el cáncer. Como su nombre lo indica, se presentan estas moléculas de oxígeno, que existe naturalmente como una molécula de dioxígeno estable, ya que sus electrones se aparean. La adición de un electrón desapareado hace inestable y lleva a la formación del anión superóxido, una forma de especie reactiva del oxígeno o ROS. Que no sea el anión superóxido, hay varios tipos de especies reactivas con electrones no apareados, cuyos niveles de la célula tiene como objetivo controlar firmemente.

En este video, aprenderemos cómo reactivas del oxígeno especies están relacionados con la célula metabolismo y enfermedad, explorar los principios detrás de un análisis para su detección utilizando una sonda fluorescente e irá sobre un protocolo generalizado de este análisis. Por último, a investigar cómo los científicos están aplicando este método en experimentos hoy.

En primer lugar, vamos a discutir cómo reactivas del oxígeno especies se producen y consideran su influencia en el metabolismo de la célula y la enfermedad.

Una importante fuente de especies reactivas de oxígeno celular es la mitocondria. Normalmente, en célula de electrones del metabolismo son transportados a través de una cadena de complejos proteicos, que culminó en la generación simultánea de ATP y la reducción de oxígeno molecular a agua. A pesar de la regulación extraordinaria de este proceso, fugas electrones, resultando en la formación de anión superóxido.

La presencia de anión superóxido rápidamente da lugar a otras formas de especies reactivas del oxígeno, tales como el peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. Estos radicales, que todos poseen un electrón impar muy reactivo, insolubles pueden dañar las membranas, DNA y proteínas. Para contrarrestar, la célula mantiene su propio arsenal de antioxidante de enzimas como la superóxido dismutasa o moléculas como la vitamina C, que reducen los radicales libres. Cualquier desequilibrio en este sistema de defensa puede resultar en un bucle de retroalimentación positiva potencialmente fatal, resultando en una condición de especies reactivas del oxígeno excesivo conocidas como estrés oxidativo.

Especies reactivas de oxígeno se han implicado en la iniciación y progresión del cáncer. Otro efecto nocivo de estas moléculas es la inducción de envejecimiento celular, también conocida como senescencia. El "Radical libre teoría del envejecimiento" propone que las especies reactivas del oxígeno producidas en las células durante el metabolismo normal evocan muerte y senescencia celular.

Hasta ahora, hemos discutido los aspectos negativos de estas moléculas altamente reactivas, pero tienen funciones positivas en fisiología celular así. Durante las respuestas inmunitarias cuando los fagocitos engullen patógenos, células montar una "explosión respiratoria" durante la cuales cantidades excesivas de especies reactivas del oxígeno se generan para degradar oxidativamente patógenos. Además, son productos intermedios necesarios y reguladores de una variedad de vías de señalización de la célula y puede incluso señal de la muerte de las células que se han vuelto cancerosas.

Para cuantificar estos oxidantes celulares influyentes, los científicos explotan las moléculas que a oxidación fluorescentes. Una punta de prueba comúnmente utilizado para detectar las especies reactivas del oxígeno es H2DCFDA o dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato, un análogo no fluorescente de fluoresceína. Cuando se añade a las células, su naturaleza florescente de la célula permite que difunden en forma pasiva.

Entonces, esterasas intracelulares catalizan una reacción de hidrólisis, que se traduce en Máquinas Hendedoras de grupos acetato. Esto hace que el compuesto más polar, por lo que se mantiene dentro de la célula. A la oxidación, que consiste en eliminación de átomos de hidrógeno por una amplia gama de especies reactivas de oxígeno, la H2DCFDA no fluorescente se convierte en altamente fluorescente dicloro-fluoresceína, o DCF. Esto se puede leer y cuantificado por un lector de placas, citómetro de flujo o microscopia de fluorescencia.

Ahora que sabes cómo funciona este análisis, vamos a ver cómo se realiza en un entorno de laboratorio.

Comenzar con la transferencia de las células cultivadas en medio de cultivo con solución salina amortiguada de fosfatos, seguido de centrifugación para lavarlos. Eliminar el sobrenadante y agregar la solución de sonda fluorescente H2DCFDA. Incube las células cargada de tinte en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Después de la incubación se lavan las células para eliminar las células descargadas de tinte y transferencia a un plato. En este punto, se pueden agregar inductores de estrés oxidativo experimental.

Cuando esté listo para el análisis, las células se pueden insertar en el lector de placas. Las longitudes de onda de excitación y de emisión se establecen para la fluoresceína. Después se leen las placas, los valores pueden ser analizados. Los resultados revelan la cantidad relativa de especies reactivas de oxígeno entre las muestras en momentos particulares.

Ahora que hemos examinado el protocolo real, vamos a mirar cómo se es se aplica en experimentos hoy.

Los investigadores suelen utilizan este método para investigar los mecanismos de fagocitosis. Este grupo de científicos quería estudiar la capacidad del pez cebra para montar una respuesta inmune en diferentes etapas de desarrollo. Como se mencionó anteriormente, resultados de la fagocitosis en la generación de especies reactivas de oxígeno alto, o "una explosión respiratoria", se utiliza para destruir los patógenos. Puesto que la enzima oxidasa de NADPH es un productor importante de ROS en las células fagocíticas, estos científicos indujo la respuesta de explosión tratando de pez cebra con un inductor de NADPH. Los resultados demostraron que entre embriones de pez cebra cuya respuesta de "explosión" había sido provocado, los de fertilización después de 72 horas mostraban un mayor desarrollo de las especies reactivas de oxígeno que las 48 horas post fertilización.

La disfunción mitocondrial debido a especies reactivas de oxígeno aumento es una característica patológica de muchas enfermedades. Por lo tanto, los investigadores pueden identificar la disfunción mitocondrial por medir el nivel de estrés oxidativo. Aquí, los científicos carguen H2DCFDA a las neuronas y se montaron las muestras en un microscopio de fluorescencia. En adición de un estresor oxidativo, como el peróxido de hidrógeno, cuerpos celulares muestran un aumento repentino en la fluorescencia, que podría ser una indicación de la disfunción mitocondrial.

Los astrocitos se han sugerido para proteger a las neuronas del sistema nervioso central de estrés oxidativo. Debido a este significado, estos investigadores pretendían desarrollar un análisis para detectar el estrés oxidativo en los astrocitos en presencia de un inductor externo. Hicieron esto por incubación de astrocitos con peróxido de hidrógeno y la punta de prueba fluorescente para la detección de especies reactivas de oxígeno. Posterior fluorescencia generada se analizó utilizando un citómetro de flujo. Astrocitos activados por el estrés oxidativo se observan caer dentro de una región de intensidad creciente de la fluorescencia, visto desplazada a la derecha.

Sólo has visto video de Zeus en la detección de especies reactivas de oxígeno o ROS. En definitiva, en este vídeo hablamos de la relación entre especies reactivas del oxígeno, el metabolismo de la célula y la enfermedad. Luego examinamos el principio y el procedimiento de un ensayo para la detección de especies reactivas de oxígeno. Finalmente, exploramos cómo los investigadores están aplicando este método a sus investigaciones. El análisis de las funciones todavía enigmáticos de especies reactivas del oxígeno es de gran interés para los biólogos de la célula, y confiable medición con sondas fluorescentes está demostrando para ser muy valiosa. ¡Como siempre, gracias por ver!

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