基于色谱的生物大分子分离纯化方法

Biochemistry

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Summary

在生物化学领域,基于色谱的分离纯化方法来隔离从复杂混合物的化合物。两个常用的生物化学家这种方法有尺寸排阻色谱法及亲和层析。在尺寸排阻色谱中,挤满了多孔珠列分隔组件基于的混合料大小。另一方面,亲和层析可允许更具体分离的生物分子所使用的固定相,其中包含特定于目标的配体组成的列。

这个视频被作为导论尺寸排阻以及亲和层析,并管理他们的概念。所述的组氨酸标签的蛋白质固定化金属离子亲和色谱纯化的分步过程。这两种色谱方法在生物化学和生物医学研究中的应用也被异形。

"色谱"指的是广泛的方法用来隔离组件从一个复杂的混合物之前可以确定生物分子的性质和活动, 的一个重要步骤。每个色谱技术具有分离,根据样本矩阵和目标化合物的不同机制。这个视频将集中原则和操作的两种方法共同的生物化学: 和亲和尺寸排阻色谱法。

尺寸排阻色谱法或 SEC 基于样品中的化合物的大小。向与多孔材料的列添加包含样品流动相: 固定相。样品中的分子可分为三个类别 1。

分子太大,无法进入毛孔旅行通过列最短的距离。以上这种"排除限制"的分子量与任何物种将在同一时间退出列。分子小到足以自由进入毛孔将最长保留,将退出列在一起。分子量允许完整孔隙条目是"渗透极限"。

只有分子之间这些限制将会彼此分开,当他们花不同数量的时间扩散和毛孔。更小的分子被保留较长时间的列上因为他们花更多时间在固定相,而较大的分子,在这些范围内较早前退出。

在 1 到 2 个数量级的分子量范围内这些限制。在心目中,选择与此列或多列可以用于系列,如果预期的化合物种类繁多。

现在,您已经看到美国证交会的理论,让我们看看它如何进行。

要开始美国证交会过程,必须与去离子的水和色谱缓冲平衡列。一旦准备好,缓冲区包含样品注入到列。缓冲区是然后在推低流量。探测器监视什么退出列来确定所需的分析物的存在。大分子分子量高于排斥限制在同一时间退出列。从列小馏分收集管。每个分数的靶分子质量测定凝胶电泳或其他分析技术。

现在让我们来看看亲和层析或交流,纯化目的蛋白的最有效途径之一。许多生物分子选择性地绑定到某些配体一属性交流利用通过遵循一种特定于目标的配体及固定相。

当混合物流经列时,靶分子将附加到配体,以及其余流过。混合物已通过列后,可以通过两种基于特异性的洗脱方法之一收集的靶分子。

可以说是特异性洗脱了"正常"或"反向作用"。在正常作用生物特异性洗脱,代理添加粘配要绑定与目标生物分子展开了竞争。

反向作用生物特异性洗脱剂与目标要绑定到粘配体竞争。第二种洗脱类型,非特异性洗脱,通过改变溶液的 ph 值、 离子强度、 或极性降低目标对配体结合。如果一种蛋白质没有绑定到可以固定的配体,可以包含一个"标签"表达蛋白: 短肽序列工程要绑定到的配体。

一个品种是固定化金属离子亲和层析,"IMAC"的简称,在那里像镍或钴,粘金属配体,将绑定到组氨酸残基被修饰蛋白上。通过分子生物学技术,目标蛋白质生成的重复组氨酸残基,称作应运而生标记,将绑定到组氨酸的咪唑侧链通过金属。绑定后,蛋白质可以收集与免费咪唑通过反向作用具体洗脱,后来用在各种各样的下游应用程序。

现在,您已经看到亲和色谱的原理,让我们看看在实验室 IMAC 过程。

在 IMAC,固定相可以直接添加到混合物的流动相和样品,允许他标记蛋白的绑定。这个浆然后倒入的列,地方非绑定化合物滴入废物,虽然浆。浆料容器冲洗才能收集树脂残留和样品,添加到列。

树脂搅拌以确保绑定的组件自由流动。添加洗缓冲区有助于用水冲掉。一旦所有的未绑定的组件已被删除,废物被替换为一个容器,以收集目标蛋白。

含咪唑的缓冲区是添加、 搅拌,和允许休息要解除绑定的靶分子。咪唑将绑定到金属,替换和释放标记的蛋白质。收集了被释放的蛋白质,和重复咪唑步骤以确保总的集合。要进一步净化样品,可以在样品分析前运行秒。

现在,我们已经看到的理论和程序的这两种技术,让我们看看一些他们在生化领域应用的方法。

纯化目的蛋白的常见原因是研究及其在疾病中的作用。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜电导调节因子蛋白或 CFTR 缺陷引起的。成长与酵母中的他标记蛋白以后, 亲和性和尺寸排阻色谱法允许分离蛋白质,其次是其功能的研究。

在某些情况下,应运而生的标记的存在可以改变蛋白质的结构,从而影响其功能。另一个常见的标记是麦芽糖结合蛋白或 MBP,将绑定来绑定列中的直链淀粉。麦芽糖然后用于释放复杂。MBP 可以劈开然后删除与美国证交会产生纯所需的蛋白质。

你刚看了朱庇特的视频尺寸排阻及亲和层析。它覆盖技术的理论,走过去一般程序,并涵盖了一些技术的使用。

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 基于色谱的生物大分子分离纯化方法. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

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