クロマトグラフィーによる生体分子の浄化方法

Biochemistry
 

Summary

生化学、クロマトグラフィーによる精製手法を利用して、複雑な混合物から物質を分離します。生化学者で一般的に使用される 2 つの手段は、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー。サイズ排除クロマトグラフィーでは、多孔質ビーズを充填したカラムは、サイズに基づいて混合物のコンポーネントを分離します。一方、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは生体分子の特定の分離のためターゲット固有の配位子を含む液相で構成される列を使用してできます。

このビデオは、サイズ排除とアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、それらを支配する概念の導入として提供しています。固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによるヒスチジン付けられた蛋白質の浄化のためのステップバイ ステップの手順を説明します。生物化学および生物医学研究のクロマト グラフ法の両方のためのアプリケーションがプロファイルもされます。

「クロマトグラフィー」は複雑な混合物、生体分子の特性や活動を決定することができます前に不可欠なステップからコンポーネントを分離するために使用方法の広い範囲を指します。各クロマト グラフの技術は、サンプル マトリックスとターゲット化合物によって分離のための別のメカニズムを持っています。原則と生化学に共通の 2 つの操作に焦点を当てるこのビデオ: サイズ排除と親和性クロマトグラフィー。

サイズ排除クロマトグラフィーまたは SEC は、サンプル中の化合物のサイズに基づいています。多孔質材料を用いた列にサンプルを含む移動相を追加: 静止した段階。サンプルの分子は、1 の 3 つのカテゴリに分類されます。

分子が大きすぎて、毛穴を入力列を最短距離を旅行します。この「排除限界分子量"上記の分子量とのあらゆる種は同時に列を終了します。毛穴を自由に入力するには十分に小さい分子、最長保持されるため、一緒に列を終了します。完全な細孔のエントリを許可する分子量は「浸透の制限」です。

毛穴の出入りを拡散時間の様々 な量を費やすと、これらの制限の間の分子だけが、互いに区切られました。小さい分子が長時間保持される列に彼らは静止した段階のより多くの時間を過ごすためこれらの制限内で分子の大きい終了以前に対し。

1 に 2 桁全体の分子量は、これらの制限内で落ちる。心の中でこの列を選択または目的化合物の広い範囲がある場合は、シリーズで複数の列を使用できます。

今では秒の理論を見てきたを実行する方法を見てみましょう。

秒処理を開始するには、列を脱イオン水とクロマトグラフィー バッファーで平衡する必要があります。準備が整うと、サンプルを格納するバッファーを列に注入します。バッファーは、低流量域プッシュされます。検出器は、何が必要な試料の存在を決定する列終了を監視します。上記の排除限界分子量の大きな分子は、同時に列を終了します。小さな分数列からは、チューブで収集されます。各分画をゲル電気泳動やその他の分析技術ターゲット分子の品質をテストします。

今アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーまたは AC、蛋白質を浄化するために最も効率的な方法のいずれかで見てみましょう。多くの生体分子選択的に AC を固定相にターゲット固有のリガンドを付着によって利用する特定配位子をプロパティにバインドします。

リガンドは、および残りの部分を通過するとき混合物は列に流れる、標的分子が添付します。混合物はカラムに通した後、特異性に基づいて 2 つの溶出方法の 1 つを通してターゲット分子を収集できます。

生物特異的溶出と言うことが、「通常の」や「逆の役割」があります。通常役割生物特異的溶出ターゲット生体分子と結合する付着のリガンドと競合する、エージェントが追加されます。

逆ロール生物特異的溶出、エージェントは付着のリガンドをバインドするターゲットと競合します。2 番目の溶出タイプ、無指定溶出ソリューションの pH、イオン強度、または極性の変更ターゲット リガンドが削減されます。「タグ」を含む蛋白質を表現できるタンパク質はリガンドを固定化することができますバインドされません、場合: 短いペプチド配列リガンドを結合するように設計。

1 つの変化は金属イオンを固定化したアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、略して、「IMAC」ニッケルやコバルトのような付着金属のリガンドが変更された蛋白質のヒスチジン残基に結合。分子生物学的手法によるターゲット蛋白質はヒスチジン残基、ヒスチジンのイミダゾールの側鎖を介して金属にバインド polyhistidine タグと呼ばれるを繰り返し生成されます。連結された後は、蛋白質逆役割特定溶出を介して無料のイミダゾールを収集することができます、後でダウン ストリーム アプリケーションのさまざまな。

アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの理論を見てきた、今、研究室で IMAC 手順を見てみましょう。

IMAC の静止した段階は移動相と彼の付けられた蛋白質の結合をできるようにサンプルの混合物に直接追加できます。このスラリー列は、非バインドが廃棄物に滴下を化合物スラリーのままに注がれています。スラリーのコンテナーは、残留樹脂および列に追加のサンプルを収集するリンスです。

非連結の部品が自由に流れるように樹脂を攪拌します。洗浄を追加バッファーそれらを洗い流すことができます。すべての非連結コンポーネントが削除されると、廃棄物はターゲット蛋白質を収集するためのコンテナーに置き換えられます。

イミダゾールを含むバッファーが追加、攪拌、および標的分子をバインド解除する休ませます。金属、交換してタグ付きタンパク質を解放、イミダゾールにバインドします。解放されたタンパク質は、収集され、総集編をようにイミダゾール ステップが繰り返されます。さらにサンプルを浄化するには、秒は分析の前にサンプルで実行できます。

今では理論やこれらの 2 つの手法の手順を見てきたいくつかの生化学的なフィールドに適用する方法を見てみましょう。

蛋白質を浄化する一般的な理由は、病気での役割を研究することです。嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御するタンパク質、または CFTR の欠陥によって引き起こされます。酵母で his タグを持つタンパク質を成長後親和性とサイズ排除クロマトグラフィーその機能の研究に続いて、蛋白質の分離を許可します。

いくつかのインスタンスで polyhistidine タグの存在は、蛋白質の構造、機能に影響することを変更できます。別の一般的なタグはマルトース結合タンパク質や MBP は、アミロースを列にバインドするバインドされます。マルトースは、複雑なを解放する使用されます。MBP の切断および純粋な目的タンパク質を生成する秒を削除できます。

サイズ排除と親和性クロマトグラフィーでゼウスのビデオを見てきただけ。それはテクニックの理論を覆われて、一般的な手順は、行き、技術の用途のいくつかをカバーします。

見てくれてありがとう!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. クロマトグラフィーによる生体分子の浄化方法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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