Electroforesis en Gel bidimensional

Biochemistry

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Summary

Electroforesis en gel bidimensional (2DGE) es una técnica que puede resolver miles de biomoléculas de la mezcla. Esta técnica consiste en dos métodos de separación diferentes que han sido acoplados entre sí: la concentración isoeléctrica (IEF) y sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE). Esto físicamente separa compuestos a través de dos ejes de un gel por sus puntos isoeléctricos (una propiedad electroquímica) y sus pesos moleculares.

El procedimiento en este video cubre los principales conceptos de 2DGE y un procedimiento general para la caracterización de la composición de una solución de proteína compleja. En la sección de aplicaciones, incluyendo la detección de biomarcadores para la iniciación de la enfermedad y tratamiento de pacientes y el estudio de las proteínas después de modificación postraduccional (PTM) de seguimiento del progreso, se muestran tres ejemplos de esta técnica.

Bidimensional, o 2D, electroforesis en gel es una técnica que utiliza dos métodos de separación diferentes que pueden separar miles de proteínas de una mezcla única. Una de las técnicas, SDS-PAGE o sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis, puede separar completamente solo de mezclas complejas. Electroforesis 2D parejas SDS-PAGE a un segundo método, isoeléctrico centrado o IEF, que partiendo de puntos isoeléctricos se separa, lo que permite la resolución de potencialmente todas las proteínas en una célula lisado. Este video le mostrará que los principios de 2D gel de electroforesis, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones biomédicas.

Electroforesis 2D comienza con IEF como la primera dimensión. Cada proteína tiene un valor de pH, llamado punto isoeléctrico o pI, donde la carga neta es cero. Cuando una proteína se somete a un campo eléctrico, se moverá hacia el electrodo con carga opuesta. Muestras de interés se cargan en el gradiente de pH inmovilizado, o IPG, tiras que han encajado anfolitos, moléculas que contienen grupos ácidos y básicos. Un campo eléctrico se aplica a la franja de gradiente de pH, haciendo que las proteínas que migran hasta alcanzar el valor de pH que empareja su pI, donde pierden su carga neta.

Antes de ejecutar la segunda dimensión, las proteínas incrustadas son tratadas con SDS, los desnaturalizantes y proporciona una carga negativa uniforme. Una vez completado, las tiras IPG se colocan en un gel de poliacrilamida. Un aplicado campo eléctrico atrae las proteínas hacia el ánodo, con proteínas más grandes moviéndose más lentamente a través del gel.

Una vez que se ha separado la mezcla de proteínas según peso molecular y el pI, se visualiza el mapa del proteoma con manchas, y proteínas de interés se identifican.

Ahora que hemos discutido los principios de la electroforesis en 2D, vamos un procedimiento de laboratorio típico.

Antes de que el experimento se puede realizar, las proteínas deben solubilizadas en los medios de comunicación. Solubilización de la muestra se obtiene por la agregación de proteínas con una combinación de agentes caotrópico para interrumpir las interacciones de unión de hidrógeno, detergentes no iónicos para evitar la alteración de la carga de las proteínas, agentes reductores para romper los enlaces disulfuro y tampones. Para eliminar interferencias abundantes proteínas y otras moléculas, el material se extrae secuencialmente por centrifugación y la colección del precipitado resultante; seguido por el tratamiento con la endonucleasa, una enzima usada para consumir cualquier ADN que pueda interferir con el experimento.

Una vez que las proteínas han sido solubilizadas, IPG strips son preparados mediante enjuague con una solución de limpieza de la tira y dejar boca abajo para secar. Cada tira entonces se asigna a un número de titular de la tira. Una vez listos, el extracto celular se carga en las tiras en un movimiento lento, desplazamiento desde el negativo al extremo positivo. Con el propósito de rehidratación, papel secante húmedo se coloca en la parte superior del electrodo y debajo de las tiras de gel; las tiras IPG se alinean entonces en el instrumento IEF. Se aplica una corriente eléctrica de alta, y las proteínas comienzan a migrar.

Después de la finalización de la primera dimensión, el gel de SDS-PAGE se prepara en un aparato de fundición. Las tiras IPG son tratadas por colocarlos cara en tampón de equilibrado que contienen SDS. La unidad de electroforesis es preparada con la adición de tampón de electroforesis. Las tiras IPG tratadas se recogen con unas pinzas, colocar sobre las placas de gel y sellados con la solución de agarosa de sellado. Una fuente de tensión aplica un campo eléctrico, que se celebra hasta que las proteínas más rápido-mudanza son 1 cm de la parte inferior del gel.

Después de la terminación de la electroforesis, las proteínas deben ser visualizadas. Tradicionalmente esto se realiza mediante tinción con nitrato de plata o azul de Coomassie. Proteínas de interés pueden transferidas desde el gel y analizadas por análisis de Western blot.

Un segundo enfoque de identificación consiste en la supresión de las proteínas del gel, digerir, que el análisis por espectrometría de masas.

Ahora que hemos revisado un procedimiento, Veamos algunas de las aplicaciones para electroforesis en 2D.

Uno de los usos más comunes de esta técnica es la identificación de moléculas implicadas en la progresión y la iniciación de la enfermedad. Electroforesis 2D, juntada con la espectrometría de masas, pueden detectar la para arriba - o abajo-regulación de proteínas específicas en áreas enfermas con las sanas.

Además, electroforesis en 2D es útil siguiendo el progreso de la respuesta de pacientes a un fármaco terapéutico potencial. Pueden tomarse muestras de pacientes en diferentes puntos de tiempo después de la administración del tratamiento. De esta manera, electroforesis 2D, junto con Western blot o análisis de espectrometría de masas, puede detectar proteínas asociadas con respuestas negativas tales como inflamación; o la ausencia de proteínas en un estado aliviada.

Otro uso para electroforesis en 2D es en el estudio de la estructura de la proteína y la función después de modificación postraduccional o PTM, que son adiciones a proteínas después de su traducción de mRNA. PTM puede regular una variedad de funciones, incluyendo la proteína de señalización, expresión génica, o causar daño oxidativo. Electroforesis en 2D es sensible a las modificaciones tales como metilación o acetilación, lo cual puede causar un cambio en pI, así como el peso molecular.

Sólo ha visto video de Zeus en electroforesis en 2D. Este video describe los principios de la técnica, un procedimiento experimental típico y varias de sus aplicaciones en el campo de la biomedicina.

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Electroforesis en Gel bidimensional. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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