Marquage métabolique

Biochemistry

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Summary

Marquage métabolique est utilisé pour sonder les transformations biochimiques et les modifications qui se produisent dans une cellule. Ceci est accompli en utilisant les analogues chimiques qui imitent la structure des biomolécules naturel. Les cellules utilisent analogues dans leurs processus biochimiques endogènes, production de composés qui sont étiquetés. L’étiquette permet l’incorporation de détection et de balises d’affinité, qui peuvent alors servir à élucider les voies métaboliques à l’aide d’autres techniques d’analyse biochimiques, tels que le SDS-PAGE et RMN.

Cette vidéo présente les concepts de métabolique d’étiquetage et de montrer deux procédures général.  Le premier utilise le marquage isotopique, pour caractériser la phosphorylation d’une protéine. La deuxième couvre un étiquetage photoréactive afin de caractériser les interactions protéine-protéine dans un Also trois demandes de marquage métabolique sont présentés : étiquetage des matières végétales, RNA pour mesurer la cinétique de marquage et l’étiquetage des glycanes dans le développement des embryons.

Marquage métabolique est utilisée pour étudier les mécanismes d’une cellule. Ceci est accompli en utilisant les analogues chimiques pour sonder les transformations biochimiques et les modifications qui se produisent. Cette vidéo va montrer les principes de marquage métabolique, typique isotopiques et photoréactive étiquetage des procédures et certaines applications.

Marquage métabolique peut être effectuée à l’aide d’un certain nombre de stratégies. Nous décrirons ici d’étiquetage isotopique photoréactive et bio-orthogonaux.

Marquage isotopique est effectuée à l’aide des analogues structures qui sont chimiquement identiques à leurs équivalents naturels, mais ont des isotopes rares incorporés dans leur structure. Dans cet analogue de L-lysine, les atomes de carbone et d’azote sont remplacés par 13C et 15N. Les cellules cultivées en présence d’isotopiques analogues les intégrera dans leurs structures biochimiques. Les métabolites sont prélevés dans les cellules et purifiés pour l’analyse. Les échantillons avec les isotopes stables sont analysés à l’aide de techniques comme la spectrométrie de masse et spectroscopie RMN. Échantillons avec des étiquettes radioactifs sont analysées à l’aide de films de comptage et de rayons x par scintillation liquide, qui se traduira dans le protocole de marquage isotopique.

Les étiquettes photoréactifs sont des groupes fonctionnels incorporés dans les protéines, qui sont stables jusqu'à exposés aux rayons ultraviolets. Le groupe fonctionnel constitue un radical réactif, qui se lie à la protéine le plus proche. Un exemple courant, photo-L-leucine, contient un anneau de diazirine, qui est une RETICULATION photoréactive. Contrairement au marquage isotopique, il y a quelques chimique dissimilarité entre photo réactifs chimiques analogues et leurs homologues naturels. Les cellules peuvent incorporer préférentiellement composés naturels sur analogues. Par conséquent, il est important d’effectuer le marquage photoréactifs dans un milieu libre de ce composé étant imité. Une fois exposé aux rayons ultraviolets, les groupes photo-réactifs dans une protéine marquée devient instable et très réactif, amenant à réticuler avec les protéines qui interagissent, créant une protéine complexe. Réticulé complexes, agissent comme des instantanés qui peuvent ensuite être analysés à l’aide de SDS-PAGE et les méthodes de spectrométrie de masse. Cela permet de mieux comprendre les réactions qui sont produisent dans la voie métabolique en identifiant l’espèce de réaction et comment ils interagissent en déterminant les sites de liaison.

Bioorthogonal stratégies étiquetage utilisent analogues avec des petits groupes fonctionnels qui n’ont peu ou aucun réactivité avec des biomolécules naturels. Par exemple, les azotures sont petits groupes fonctionnels, dont la réactivité est dite orthogonale aux réactions biochimiques. Dans la ligature de Staudinger, un groupe de phosphine attaque le groupe azido. Cela donne un état de transition qui réagit de façon intramoléculaire avec un ester à proximité, ce qui entraîne un ligand amine-collé. Groupes fonctionnels de bioorthogonal incorporés dans les biomolécules peut être ligaturés avec des balises de détection comme des groupes fonctionnels fluorescents et affinité tags comme antigènes.

Maintenant que certains concepts et stratégies pour l’étiquetage métaboliques ont été discutées, examinons le processus en laboratoire.

La première étape dans une expérience de marquage métabolique consiste à recueillir de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, les cellules sont cultivées sur une plaque et une méthode d’expression sert à promouvoir la synthèse de la protéine désirée. Dans cet exemple, la leucine-rich repeat kinase ou LRRK, sont exprimées. Phosphate disodique, contenant du phosphore radioactif-32, est utilisé comme l’analogue. Mesures appropriées doivent être prises pour protéger contre les rayonnements ionisants. Cela inclut la mise en place d’un espace de travail, porter un équipement de protection et la vérification de la contamination radioactive. Une fois que les mesures de sécurité ont été prises, le milieu contenant les analogues isotopiques est prête. Le milieu de la culture est supprimé et remplacé par celui contenant les analogues chimiques isotopiques et puis incubé. Après incubation, les cellules sont lysées. Le lysat est recueilli et purifié.

Après purification, les protéines sont résolus par SDS-PAGE et puis transférés sur une membrane de PVDF. Autoradiographie est effectuée en exposant la membrane pour film à rayons x et mesurée à l’aide d’un imageur de phosphore. Western Blot est utilisé pour mesurer des niveaux relatifs de protéines dans la membrane PVDF. Dans cet exemple, les niveaux de la phosphorylation de la leucine-rich répéter kinases synthétisé dans 293 t, les cellules ont été mesurés. L’autoradiogram montre combien de phosphore a été incorporé dans la protéine. Western Blot élucide les niveaux des protéines LRRK. Logiciel d’analyse image sert à obtenir des données quantitatives des niveaux de la phosphorylation des protéines.

Dans cette procédure suivante, étiquetage photoréactive est démontrée. Tout d’abord, les cellules sont préparés et mis en culture. L’analogique photoréactive est ajouté aux cellules lors de la phase logarithmique et incubé. Dans cette procédure, p-benzoylphénylalanine est utilisé. Les échantillons sont prélevés sur des intervalles et mettent sur la glace. Les échantillons sont ensuite exposés pour obtenir des instantanés des voies biochimiques au fil du temps. Les protéines d’intérêt sont ensuite purifiés et résolu à l’aide de SDS-PAGE.

Une stratégie d’étiquetage photoréactive servait à identifier les composés qui interagissent avec la protéine d’intérêt. Immunodétection avec Western blotting montre des bandes de protéines qui indiquent des protéines de poids moléculaire plus élevés sont présents dans les échantillons irradiés. Ce sont de réticulation en raison de l’interaction protéine-protéine se produisant au cours de l’irradiation UV.

Maintenant que nous avons passé en revue les procédures de marquage métaboliques, regardons quelques-unes des façons que le processus est utilisé.

Notions de marquage métaboliques peuvent être étendues à des organismes pluricellulaires. Plantes sont cultivées dans un environnement fermé, riches en isotopes stables pour les matières végétales étiquetées produite. Dioxyde de carbone contenant du carbone-13 est ajouté à l’enceinte, tandis que l’azote-15 riche engrais est utilisé. Le produit de la plante récoltée peut aider à répondre aux questions sur le carbone et le cycle de l’écosystème de l’azote.

L’étiquetage permet la séparation des ARN nouvellement synthétisé de l’ARN plus âgé. En changeant la concentration initiale de l’analogique, la cinétique de la synthèse de l’ARN peut être déterminée. Les résultats montrent que la concentration de 4-thiouridine affecte combien nouveaux RNA est transcrit. En outre, les taux d’incorporation de l’étiquette dans l’ARN peuvent être directement quantifiés avec un spectrophotomètre.

À l’aide de chimie de clic établies, glycanes dans un embryon de poisson zèbre peut être étiqueté. Les oeufs sont injectés avec un étiquetage composé qui en résulte dans les étiquettes de l’alcyne sur les glycanes. Les glycanes chez les larves sont ensuite ligaturés à un composé de colorant à l’étape de l’évolution souhaitée. Les glycanes chez les embryons sont ensuite imagés. Glycanes produites à des moments différents peuvent être identifiés par marquage à l’aide de différentes couleurs à différents stades du développement embryonnaire.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur marquage métabolique. Cette vidéo décrit les concepts de marquage métabolique et leurs stratégies, passe deux procédures générales et certaines des utilisations des techniques couverts.

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JoVE Science Education Database. L'essentiel de la biochimie. Marquage métabolique. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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