Metabolische Kennzeichnung

Biochemistry

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Summary

Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Sonde die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die in einer Zelle auftreten. Dies wird erreicht durch den Einsatz von chemischen Analoga, die die Struktur des natürlichen Biomoleküle zu imitieren. Zellen nutzen Analoga in ihrer endogenen biochemischen Prozessen, Herstellung von Verbindungen, die beschriftet werden. Das Label ermöglicht die Einbindung von Erkennung und Affinität-Tags, die dann verwendet werden, um mit anderen biochemischen analytischen Techniken, wie SDS-PAGE und NMR Stoffwechselwege aufzuklären.

Dieses Video stellt die Konzepte der metabolischen Kennzeichnung und zeigen zwei allgemeine Verfahren.  Die erste verwendet Isotopen-Etikettierung, um die Phosphorylierung eines Proteins zu charakterisieren. Die zweite Abdeckungen photoreaktiven Kennzeichnung zur Charakterisierung von Protein-Protein Interaktion innerhalb einer Also drei Anwendungen der metabolischen Kennzeichnung werden vorgestellt: Kennzeichnung Pflanzenmaterial, RNA zur Messung der Kinetik Kennzeichnung und Etikettierung Glykoproteinen bei der Entwicklung von Embryonen.

Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Maschinerie einer Zelle untersuchen. Dies erfolgt mit chemischen Analoga, Sonde, die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die auftreten. Dieses Video zeigt die Grundsätze der metabolischen etikettieren, typische Isotopen und photoreaktiven Kennzeichnung Verfahren und einige Anwendungen.

Metabolische Kennzeichnung kann mit eine Reihe von Strategien durchgeführt werden. Hier beschreiben wir Isotopen, Photoreaktive und Bio-orthogonal zu beschriften.

Isotopen Kennzeichnung erfolgt über strukturelle Analoga, die zu ihren natürlichen Gegenstücken chemisch identisch sind, aber selten Isotope integriert ihre Struktur. In dieser L-Lysin-Analog werden die Kohlenstoff und Stickstoff-Atome durch Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 ersetzt. Zellen in Anwesenheit von Isotopen Analoga kultiviert werden sie in ihrer biochemischen Struktur integrieren. Metaboliten werden aus den Zellen gesammelt und gereinigt für die Analyse. Proben mit stabilen Isotope werden analysiert, mit Techniken wie Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie. Proben mit radioaktiven Etiketten werden analysiert, mit liquid funkeln zählen und x-ray-Filme, die in der isotopischen Kennzeichnung Protokoll nachgewiesen werden.

Photoreaktive Etiketten sind funktionelle Gruppen integriert Proteine, die stabil bis UV-Licht ausgesetzt sind. Die funktionelle Gruppe bildet eine reaktive Radikale, die das nächste Protein bindet. Ein typisches Beispiel, L-Foto-Leucin, enthält einen Diazirine-Ring, der einem photoreaktiven Vernetzer ist. Im Gegensatz zu den Isotopen zu beschriften, gibt es einige chemische Unähnlichkeit zwischen Foto-reaktive chemische Analoga und ihre natürlichen Pendants. Zellen können über Analoga bevorzugt Naturstoffe enthalten. Daher ist es wichtig, führen Sie Foto-reaktive Kennzeichnung in Medium frei von der Verbindung wird nachgeahmt. Wenn ultraviolette Strahlung ausgesetzt, werden die Foto-reaktiven Gruppen in einem beschrifteten Protein instabil und hochreaktive, wodurch es zu vernetzen mit interagierenden Proteine, erstellen ein Protein Komplex. Vernetzte komplexe wirken wie Momentaufnahmen, die dann mit SDS-PAGE und Massenspektrometrie Methoden analysiert werden können. Dies gibt Einblicke in welche Reaktionen in den Stoffwechselweg durch die Identifizierung Reaktion Arten auftreten und wie sie interagieren durch die Bestimmung Bindungsstellen.

Bioorthogonal-Kennzeichnung-Strategien nutzen Analoga mit kleinen funktionellen Gruppen, die wenig bis gar keine Reaktivität mit natürlichen Biomoleküle zu haben. Azides sind beispielsweise kleine funktionelle Gruppen, deren Reaktivität orthogonal zur biochemischen Reaktionen werden soll. In der Staudinger-Ligatur greift eine Phosphin-Gruppe die Azido-Gruppe. Daraus ergibt sich ein Übergangszustand, der Atropisomerie mit einer nahe gelegenen Ester, was zu einem Amin-gebundenen Liganden reagiert. Bioorthogonal funktionelle Gruppen integriert Biomoleküle können mit Erkennung Tags wie fluoreszierende Funktionsgruppen ligiert und Affinität Stichwörter wie Antigene.

Nun, einige Konzepte und Strategien für die metabolische Bezeichnung diskutiert worden sind, schauen Sie sich bitte an den Prozess im Labor.

Der erste Schritt in einem metabolischen Kennzeichnung Experiment ist das Protein des Interesses zu sammeln. Zu diesem Zweck werden Zellen auf einem Teller angebaut, und eine Ausdruck-Methode wird verwendet, um die Synthese des gewünschten Proteins zu fördern. In diesem Beispiel Leucin-reiche wiederholen Kinasen oder LRRK ausgedrückt. Binatrium Phosphat, mit radioaktivem Phosphor-32, dient als die analogen. Angemessene Maßnahmen zum Schutz vor ionisierender Strahlung. Dazu gehören ein Arbeitsbereich einrichten, angemessene Schutzausrüstung tragen und auf radioaktive Kontamination überprüft. Sicherheitsmaßnahmen getroffen haben, ist das Medium mit der isotopischen Analoga bereit. Das Medium aus der Kultur ist entfernt und ersetzt mit einem mit der isotopischen chemische Analoga und dann bebrütet. Nach Inkubation sind die Zellen lysiert. Die lysate gesammelt und gereinigt.

Nach der Reinigung werden Proteine aufgelöst, mit SDS-PAGE und dann auf einer PVDF-Membran übertragen. Autoradiographie wird durchgeführt, indem man die Membran um Röntgen-Film und mit einem Phosphor Imager gemessen. Westliche Beflecken wird verwendet, um relative Proteingehalt in der PVDF-Membran zu messen. In diesem Beispiel wiederholen die Phosphorylierung Ebenen der Leucin-reiche Kinasen in 293T synthetisiert, die Zellen gemessen wurden. Die Autoradiogram zeigt wieviel Phosphor wurde in das Protein aufgenommen. Westliche Beflecken, erläutert die Ebenen der LRRK Proteine. Bildanalyse-Software dient zur quantitativen Daten der Phosphorylierung Ebenen der Proteine zu erhalten.

In diesem nächsten Verfahren zeigt photoreaktiven beschriften. Erstens sind die Zellen vorbereitet und kultiviert. Die photoreaktiven Analog ist hinzugefügt, um die Zellen in der Mitte des Log-Phase und inkubiert. In diesem Verfahren wird p-Benzoylphenylalanine verwendet. Proben werden in Abständen gesammelt und auf Eis gelegt. Die Proben werden dann ausgesetzt, um Schnappschüsse von der biochemischen Bahnen im Laufe der Zeit zu erhalten. Interessierender Proteine werden dann gereinigt und mit SDS-PAGE aufgelöst.

Eine Photoreaktive Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem Protein des Interesses zu interagieren. Immunodetection mit Western Blot zeigt Protein-Bands, die höheren Molekulargewicht Proteinen anzugeben sind im bestrahlten Proben vorhanden. Diese sind von Vernetzung durch Protein-Protein Wechselwirkung auftritt während der UV-Bestrahlung.

Nun, da wir metabolische Kennzeichnung Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, die der Prozess verwendet wird.

Metabolische Kennzeichnung Konzepte erweiterbar auf vielzellige Organismen. Pflanzen wachsen in einer geschlossenen Umgebung reich an stabile Isotope, produzierten beschrifteten Pflanzenmaterial. Kohlendioxid mit Kohlenstoff-13 ist das Gehäuse, während Stickstoff-15 hinzugefügt, die reiche Dünger verwendet wird. Das daraus resultierende geerntete Pflanzenmaterial kann Fragen zu Kohlenstoff und Stickstoff aus dem Ökosystem Radsport beantworten helfen.

Kennzeichnung ermöglicht die Trennung der neugebildete RNA von älteren RNS. Durch die Veränderung der Ausgangskonzentration des Analog, kann die Kinetik der neuen RNS-Synthese bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4-Thiouridine beeinflusst, wie viel neue RNA transkribiert wird. Darüber hinaus können Aufnahme Preise des Labels in RNA direkt mit einem Spektrophotometer quantifiziert werden.

Mit Biorthogonal Click-Chemie, können Glykoproteinen in ein Zebrafisch-Embryonen beschriftet werden. Die Eizellen werden mit einer Kennzeichnung Verbindung injiziert, die Ergebnisse in Alkinen Etiketten auf den Glykoproteinen. Glykanen in die Larven werden dann zu einer Farbstoff-Verbindung bei der gewünschten Entwicklung ligiert. Die Glykoproteinen in den Embryonen werden dann abgebildet. Glykane produziert zu unterschiedlichen Zeitpunkten können identifiziert werden, durch Markierung mit unterschiedlichen Farben in den verschiedenen Phasen der Entwicklung des Embryos.

Sie haben nur Jupiters Video auf metabolische Kennzeichnung angesehen. Dieses Video beschreibt die Konzepte hinter metabolische Kennzeichnung und ihre Strategien, ging über zwei allgemeine Verfahren und fallen einige der Anwendungen von den Techniken.

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Metabolische Kennzeichnung. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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