蛋白质结晶

Biochemistry

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Summary

蛋白质结晶,获得一个坚实的格子的生物分子,阐明了蛋白质的结构,并使蛋白功能的研究。结晶涉及干燥组合的许多因素,包括 ph 值、 温度、 离子强度、 蛋白质浓度下的纯化的蛋白。一旦获得晶体,可以通过 x 射线衍射和电子密度模型计算阐明蛋白质结构。

本视频介绍了蛋白质结晶和显示的一般程序。的过程中,涵盖了蛋白的表达和纯化、 结晶和 x-射线衍射。蛋白质结晶的应用包括在硅片药物设计、 绑定现场测定和膜蛋白结构分析。

蛋白质结晶是获得格构式固体形式的一种蛋白质的过程。这些水晶是结构生物学家,协助蛋白功能的研究尤为重要。其他技术,如质谱法或 SDS-PAGE,只能提供信息的一维结构的蛋白质。蛋白质结晶被辅的重组蛋白的表达和 x 射线衍射技术。本视频将显示在生化领域的蛋白质结晶,一般实验室程序,和几个及其应用原则。

在过程中所需的第一步是蛋白的获得毫克量的很纯,通常使用重组蛋白的表达。对应于感兴趣的蛋白质的基因表达载体,克隆并表达的蛋白融合到亲和标记,例如聚-组氨酸,协助亲和层析纯化。要了解更多信息,见此集合的视频上亲和层析。

纯化蛋白形成晶体是依赖于许多因素,包括 ph 值、 离子强度、 沉淀剂浓度和蛋白质、 温度和速率平衡的适当结合。使用的最常见方法是蒸气扩散,其中有两种类别: 挂滴和坐在下降。液滴含纯蛋白、 缓冲区和沉淀剂、 离子固体,束缚水分子,减少蛋白质的水供应和模仿蛋白质浓度越高,处于封闭微孔与储层更高浓度的相同的缓冲区和沉淀剂混合物。在开始时,蛋白质和沉淀剂的浓度是太低,不足以引起结晶。在实验过程中,水从液滴蒸发和收集在储层中;水在滴减少会导致系统变得饱和,和成核,其次是结晶,可以发生。水从液滴的净转移处于平衡状态,和系统维护过程完成之前。

若要可视化的三维结构,使用了 x 射线衍射。要获得晶体的 x 射线数据,它被放在单色 x 射线,在那里它被暴露在各个角度梁。每次曝光提供的图像,在每个地方是衍射 x 射线,从晶体产生、 由探测器注册。数据相结合,制作一个模型在晶体内部原子的排列。由此产生的晶体结构演示原子,典型分辨率为 2 埃的 3 维位置。

既然我们已经涵盖了蛋白质结晶的原则,让我们看看一个广义的协议。

开始执行程序将包含感兴趣的基因表达载体转化为细胞。孵育细胞和阶段中期日志,表达式由添加诱导剂,如 IPTG,触发基因的 mRNA 转录启动。后蛋白表达,原油材料悬浮在裂解缓冲液中,然后用离心法澄清。

阐明了裂解液然后装到镍列和应运而生标记蛋白将绑定到列,而所有其他生物分子都冲走了。

一旦获得了几毫克的纯蛋白质,它是准备由蒸气扩散的结晶。24 井挂/坐滴托盘充满不同浓度的氯化钠和钠醋酸缓冲溶液。坐滴方法,相同体积的蛋白质和储层的解决方案吸取到每口井,上方的架子上,然后托盘布满了透明胶带。托盘然后放在孵化室,并在井监视增长第二天,然后每隔几天。

一旦它获得了适当的水晶是准备 x 射线衍射分析。水晶被安装在测角仪定位在所选的方向位置的晶体。水晶被照明用的 x 射线在所有的角度,产生衍射图案单色光束。该软件将转换的二维图像,在不同的方向,对三维模型的测定原子在晶体中的位置晶体中的电子密度。

我们已经讨论了一种程序,让我们回顾一些有用的应用程序的蛋白质结晶和另一种结晶技术。

可用于蛋白质结晶硅药物设计中。流感病毒聚合酶碱性蛋白 2,其中已链接到病毒感染在哺乳动物中,三维结构测定结晶和 x 射线衍射。潜在的蛋白结合位点的可视化,并使用对接程序,设计了一个三维分子,会插入在蛋白质中的裂缝。

合作的结晶的蛋白质-DNA 复合物也是一个有用的技术。DNA 结合蛋白调节种类繁多的生物功能,如转录和 DNA 聚合和 DNA 修复;和这些配合物的晶体结构可以洞察蛋白质的功能、 机制及特异性相互作用的性质。大肠杆菌蛋白 SeqA,负性调节因子的 DNA 复制,是与半甲基化 DNA 位共同结晶。

一体式膜蛋白质如 G 蛋白偶联受体或 GCPRs,很难结晶由于其数量有限的极性表面积供形成晶体的晶格接触,导致融合蛋白辅助蛋白质结晶的发展。编码 β 2 肾上腺素能受体、 GCPR 和溶菌酶基因被插入表达载体。Β2AR 溶菌酶融合蛋白质结晶过程被达到由于增加胞外亲水表面自然疏水 β2AR,提供的溶菌酶,成型包装的相互作用在晶体点阵的必要条件。

你刚看了朱庇特的视频对蛋白质结晶。这段视频描述其原则、 广义的议定书 》,和一些及其在生物医学领域的应用。谢谢观赏 !

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JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 蛋白质结晶. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

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