Cristallisation de protéines

Biochemistry

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Summary

La cristallisation de protéines, obtention d’un solid réseau de biomolécules, élucide la structure des protéines et permet l’étude de la fonction des protéines. Cristallisation implique une protéine purifiée sous une combinaison de nombreux facteurs, y compris le pH, la température, force ionique et la concentration de protéines de séchage. Une fois que les cristaux est obtenus, la structure de la protéine peut être élucidée par diffraction des rayons x et le calcul d’un modèle de densité électronique.

Cette vidéo présente la cristallisation de protéines et montre une procédure générale. Expression de la protéine et purification, cristallisation et diffraction des rayons x sont couvertes dans la procédure. Applications de la cristallisation de protéines incluent conception de médicaments in silico , liaison site détermination et analyse de structure des protéines membranaires.

La cristallisation de protéines est le processus d’obtention d’une forme solide treillie d’une protéine. Ces cristaux est particulièrement utiles pour les biologistes structures, aider dans l’étude de la fonction des protéines. Autres techniques, telles que la masse spec ou SDS-PAGE, ne peuvent fournir d’informations sur la structure unidimensionnelle des protéines. La cristallisation de protéines est complétée par les techniques d’expression de protéine recombinante et diffraction des rayons x. Cette vidéo va montrer les principes de la cristallisation de protéines, une procédure de laboratoire général et plusieurs de ses applications dans le domaine biochimique.

La première étape nécessaire dans le processus est d’obtenir des quantités de milligramme de protéines très pures, généralement à l’aide d’expression de protéine recombinante. Le gène correspondant à la protéine d’intérêt est cloné dans un vecteur d’expression, et la protéine exprimée est fusionnée à une balise d’affinité, comme poly-histidine, pour aider à la purification par chromatographie d’affinité. Pour en savoir plus, voir la vidéo de cette collection sur la chromatographie d’affinité.

Formation de la protéine purifiée en cristaux dépend de la bonne combinaison de nombreux facteurs, y compris le pH, force ionique, les concentrations de précipitant et protéines, température et taux d’équilibration. La méthode la plus couramment utilisée est la diffusion de la vapeur, dont il existe deux catégories : suspension drop et baisse de la séance. Une gouttelette contenant la protéine pure, tampon et précipitant, qui est un ionique solide qui lie les molécules d’eau, réduisant la disponibilité de l’eau pour la protéine et imitant la concentration plus élevée de protéines, est dans un puits clos avec un réservoir avec un mélange plus très concentré du même tampon et précipitant. Au début, les concentrations de protéine et précipitant sont trop faibles pour provoquer la cristallisation. Au cours de l’expérience, l’eau se vaporise de la goutte et s’accumule dans le réservoir ; une diminution de quantité d’eau dans la goutte oblige le système à devenir sursaturés, et nucléation, suivie par cristallisation, peut survenir. Les transferts nets de l’eau de la goutte sont en équilibre, et le système est maintenu jusqu'à ce que le processus est terminé.

Pour visualiser la structure 3D, diffraction des rayons x est utilisée. Pour obtenir des données de rayons x d’un cristal, il est placé dans un faisceau de rayons x monochromatiques, où elle est exposée à la poutre à tous les angles. Chaque exposition donne une image, où chaque endroit est une rayons x diffractée, qui émerge de la crystal et est enregistrée par un détecteur. Les données sont combinées pour produire un modèle de l’arrangement des atomes dans le cristal. La structure cristalline qui en résulte montre le placement 3-dimensions des atomes, avec une résolution typique de 2 angströms.

Maintenant que nous avons couvert les principes de la cristallisation de protéines, penchons-nous sur un protocole généralisé.

Pour commencer la procédure, un vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt se transforme en cellules. Les cellules sont incubées et en phase logarithmique, expression est enclenchée en ajoutant un inducteur, tels que l’IPTG, qui déclenche la transcription de l’ARNm du gène. Après l’expression de la protéine, le matériau brut est en suspension dans le tampon de lyse et ensuite clarifié par centrifugation.

La clarification lysat est ensuite chargé dans une colonne de nickel, et la protéine polyhistidine-tag se lie à la colonne alors que tous les autres biomolécules sont emportés.

Une fois plusieurs milligrammes de protéines pures ont été obtenus, il est prêt pour la cristallisation de la diffusion de la vapeur. Un plateau de 24 puits suspendus/séance goutte regorge de diverses concentrations de chlorure de sodium et solutions tampon de sodium acétate. Pour la séance baisse de méthode, des quantités égales de protéines et le réservoir de solution sont distribuées sur le plateau au-dessus de chaque puits et puis le plateau est recouvert de ruban adhésif transparent. Le plateau est ensuite placé dans une chambre d’incubation et les puits sont surveillés pour le lendemain, puis tous les quelques jours de croissance.

Une fois un bon cristal a été obtenu, il est prêt pour l’analyse de la diffraction des rayons x. Le cristal est monté sur un goniomètre pour placer le cristal aux orientations choisies. Le cristal est éclairé par un faisceau monochromatique de rayons x dans tous les angles, produisant un schéma de diffraction. Le logiciel convertit les images bidimensionnelles, prises à des orientations différentes, à un modèle tridimensionnel de la densité d’électrons dans le cristal en déterminant la position des atomes dans le cristal.

Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, passons en revue quelques applications utiles de la cristallisation de protéines et une autre technique de cristallisation.

La cristallisation de protéines peut servir à en silico conception de médicaments. La structure tridimensionnelle de polymérase protéine basique du virus de la grippe 2, qui a été liée à une infection virale chez les mammifères, a été déterminée par la cristallisation et la diffraction des rayons x. Les sites potentiels de liaison dans la protéine sont visualisées, et avec l’utilisation d’un programme d’accueil, une molécule en trois dimensions a été conçue qui serait insérer dans une fente dans la protéine.

Cocristallisation des complexes protéine-ADN est également une technique utile. Protéines de liaison à l’ADN modulent une grande variété de fonctions biologiques telles que la transcription et la polymérisation de l’ADN et la réparation de l’ADN ; et les structures cristallines de ces complexes peuvent donner un aperçu de la fonction de protéine, mécanisme et la nature de l’interaction spécifique. La protéine d’e. coli SeqA, un régulateur négatif de la réplication de l’ADN, a été cocristallisée avec ADN hemimethylated.

Protéines intégrales de membrane comme récepteurs, ou GCPRs, couplés aux protéines G sont difficiles à se cristalliser en raison de leur nombre limité de surface polaire disponible pour former les contacts du réseau cristallin, qui a conduit à l’élaboration de la cristallisation de la protéine de fusion-protéine-assistée. Gènes codant pour des récepteurs adrénergiques β2, un GCPR et un lysozyme furent insérées dans un vecteur d’expression. La cristallisation de la protéine de fusion β2AR-lysozyme a été obtenue grâce à une surface hydrophile extracellulaire accrue sur le β2AR naturellement hydrophobe, fournies par le lysozyme, nécessaire pour former des interactions d’emballage dans le réseau cristallin.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la cristallisation de protéines. Cette vidéo décrit ses principes, un protocole généralisé et certains ses utilisations dans le domaine biomédical. Merci de regarder !

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L'essentiel de la biochimie. Cristallisation de protéines. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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