Enzym-Assays und Kinetik

Biochemistry
 

Summary

Enzym-Kinetik beschreibt die katalytische Wirkung von Enzymen, die Biomoleküle, die chemische Reaktionen notwendig für lebende Organismen zu erleichtern. Enzyme wirken auf Moleküle, als Substrate für Form-Produkte bezeichnet. Enzym kinetische Parameter werden über Assays bestimmt, die direkt oder indirekt Substrat oder Produkt Konzentrationsänderungen im Laufe der Zeit messen.

Dieses Video wird die grundlegenden Prinzipien der Enzym-Kinetik (einschließlich Ratengleichungen) und kinetische Modelle decken. Die Konzepte für die Enzym-Assays werden ebenfalls behandelt, gefolgt von einer typischen farbmetrischen Assay. Im Anwendungsabschnitt wird einen Enzym-Assay über Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Analyse, Charakterisierung von extrazellulären Enzymaktivität in der Umgebung und Ermittlungsbehörden DNA Reparatur Kinetik mit molekularen Sonden.

Enzyme sind biochemische Katalysatoren, die lebensnotwendig sind. Enzym-Assays werden verwendet, um die kinetischen Eigenschaften der enzymatischen Reaktionen, Aufklärung der katalytischen Wirkung von Enzymen zu studieren. Dieses Video deckt Enzym Kinetik und Assays, gehen über ein allgemeines Verfahren, und zeigen einige Anwendungen.

Enzyme sind Proteine oder Protein-ähnliche Moleküle, die auf ein Edukt-Molekül als Substrat bezeichnet. Enzyme reduzieren die Aktivierungsenergie von biochemischen Reaktionen. Dadurch können Reaktionen auftreten, schneller Preisen mit niedrigeren Energiebedarf.

Enzymatische Reaktionen können in drei elementaren Bestandteile aufgeteilt werden. Die erste ist die Bildung von Enzym-Substrat-Komplex, gebildet durch die Bindung des Substrats an das Enzym aktiven Seite. Die Anlage kann in seine ursprünglichen Bestandteile zerlegen. Dies ist die zweite Grundschule Reaktion. Alternativ kann die Anlage bilden das Produkt und das Enzym, das dritte elementare Reaktion zu erholen.

Die Kinetik einer elementaren Reaktion ist durch die elementaren Rate Gesetz Gleichung gegeben. Ratengleichungen Recht geben die Rate in Bezug auf die Konzentration der Reaktanden und eine Geschwindigkeitskonstante. Die Elementarreaktionen jeweils eine individuelle Rate Gesetz Gleichung mit eigenem Geschwindigkeitskonstante. Diese Gleichungen können bis zu einer kinetischen Modell, bekannt als die Michaelis-Menten-Gleichung destilliert werden. Dies gibt die Geschwindigkeit der Reaktion in Bezug auf die Substratkonzentration; die experimentell ermittelt werden kann. Einige generelle Trends für Enzymreaktionen können unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung identifiziert werden. Bei hoher Substratkonzentration ist ein Sättigungspunkt erreicht Vmax genannt. Hier, die Rate wird durch die Konzentration der gesamten Enzym begrenzt, und die Anzahl der Substrat-Moleküle ein Enzym wandelt in Produkt pro Zeit, auch bekannt als Kcat gegeben. Im Michaelis-Menten ist Kinetik Kcat eine der zwei Konstanten, die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Die andere konstante KM, bekannt als die Affinität Konstante. KM entspricht auch die Konzentration wo die Reaktionsgeschwindigkeit ist gleichbedeutend mit einem halben Vmax. Ein Enzym mit einer höheren Affinität wird haben eine niedrigerere KM und Vmax schneller, während ein Enzym mit niedriger Affinität eine höhere KM haben und länger dauern, bis die Vmax zu erreichen. Kcat und KM erlaubt für Enzyme verglichen werden. Zu diesem Zweck verwenden wir eine Verhältnis genannt Enzym Effizienz. Kcat höheren und niedrigeren KM führen höhere Wirkungsgrade, während niedrigere Kcat und höhere KM-Ergebnisse im unteren.

Die Faktoren zur Enzym-Kinetik zu erhellen müssen experimentell ermittelt werden. Diese Tests werden in der Regel durch das Mischen von einer Enzym und Substrat-Lösung in einer kontrollierten Umgebung durchgeführt. Beobachtungen werden durch die Messung der Veränderungen in der Konzentration des Substrates, Produkt oder Nebenprodukte in Bezug auf Zeit.

Die Veränderung der Konzentration im Laufe der Zeit wird verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Für die Bestimmung die Kinetik ist Tarifdaten in mehreren Konzentrationen einzuholen. Wenn ein Grundstück von der inversen Anfangsrate vs. inverse Ausgangskonzentration, bekannt als der Lineweaver-Burk Plot, linear ist, folgt die Reaktion Michaelis-Menten Kinetik. Die Steigung und Achsenabschnitt der Linie ermöglichen die Bestimmung der kinetischen Parameter KM und Vmax, die dann zur Berechnung Kcat und die Enzym-Effizienz verwendet werden kann.

Nun, die Grundsätze der Enzym-Kinetik diskutiert haben, schauen Sie wie eine typische Enzym-Assay durchgeführt wird.

In diesem Verfahren wird ein farbmetrischen Assay demonstriert. Der erste Schritt ist eine Standardkurve generiert, die Extinktion mit Proteinkonzentration korreliert werden. Lösungen bekannter Konzentration werden zusammen mit einer Kontrollprobe vorbereitet. Eine Entwicklerlösung, die mit dem Zielprotein reagiert wird hinzugefügt, um eine farbige Verbindung zu produzieren. Extinktion gemessen und aufgetragen gegen Konzentration die Standardkurve zu generieren.

Um den Test durchzuführen, ist ein bekannter Konzentration des Substrats zusammen mit der entsprechenden Menge des Enzyms bereit. Enzym und Substrat gemischt und durfte für einen festgelegten Zeitraum zu inkubieren. pH und Temperatur werden mit Pufferlösungen und Heizblöcke gesteuert. Ein abschrecken Agent wird hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Entwicklerlösung wird dann hinzugefügt, um die Reaktionen und gemischt. Die Lösungen werden dann in Küvetten und Extinktion gemessen. Die Höhe des Substrats verbraucht wird bestimmt durch den Vergleich der gemessenen Absorption an der Standardkurve. Anhand der gesammelten Daten werden anfängliche Reaktionsgeschwindigkeiten durch Plotten Konzentration im Laufe der Zeit bestimmt. Schließlich ist mit der Tarifdaten und Konzentration, die Michaelis-Menten Handlung gemacht. Dies ermöglicht die Bestimmung der kinetischen Eigenschaften für das Enzym wie Umsatz, Anzahl und Enzym Effizienz.

Nun, da wir ein Testverfahren überprüft haben, betrachten wir andere Möglichkeiten, wie Tests durchgeführt werden und deren Anwendungen.

In diesem Verfahren Bund dient der Analyse, die Kinetik der eine Protease Eisensalz eine Peptidbindung eines Proteins zu studieren. Diese Emissionen können gemessen werden, so dass für eine kontinuierliche und quantitative Analyse Substrat Verbrauchs-und Produktionsmuster, Unterstützung bei der Bestimmung der Reaktionskinetik.

Enzym-Assays können in Umweltwissenschaften verwendet werden, um festzustellen, das Niveau der extrazellulären Enzymaktivität in der Umgebung. Gewässer, Böden und Sedimente können aus der Umgebung gesammelt und im Labor verarbeitet werden. Extrazellulären Enzymaktivität dieser Materialien kann dann mit Enzym-Assays charakterisiert werden. Dies ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis, wie die Umwelt organisches Material verarbeitet.

Eine Zelle DNA-Reparaturmechanismus kann ausgewertet werden, durch das Studium der Kinetik der Enzyme in den Zellkern. Die Rate, bei der ein Enzym DNA-Läsionen, oder Schadensersatz entfernt, kann mit fluoreszierenden molecular Beacons nur fluoreszieren, wenn Sie gebunden zu einzigartigen DNA-Sequenzen gemessen werden. Die Ebene der DNA-Reparatur kann in Echtzeit gemessen werden, indem er erkennt das Eindringmittel beschrifteten Spaltprodukte.

Sie habe nur Jupiters Video-on-Enzym Kinetik und Assays beobachtet. Dieses Video erklärt Enzym Kinetik, bedeckt Assay Konzepte, ging über ein allgemeines Verfahren, und einige Anwendungen beschrieben.

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JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Enzym-Assays und Kinetik. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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