Pruebas enzimáticas y cinética

Biochemistry
 

Summary

Cinética de la enzima describe los efectos catalíticos de las enzimas, que son biomoléculas que facilitan las reacciones químicas necesarias para los organismos vivos. Las enzimas actúan sobre moléculas, contempladas como sustratos a los productos de la forma. Parámetros cinéticos de la enzima se determinan mediante ensayos que directa o indirectamente medir los cambios en la concentración de substrato o producto con el tiempo.

Este video cubre los principios básicos de la cinética de la enzima (incluyendo las ecuaciones de velocidad) y modelos cinéticos. También se discuten los conceptos que rigen los ensayos enzimáticos, seguido por un típico análisis colorimétrico. Aplicaciones discute un análisis enzimático mediante el análisis de la transferencia (traste) de Förster Resonancia energética, caracterización de la actividad enzimática extracelular en el medio ambiente, y sondas de investigación ADN reparación cinética utilizando molecular.

Las enzimas son catalizadores bioquímicos que son esenciales para la vida. Análisis de enzima se utilizan para estudiar las propiedades cinéticas de reacciones enzimáticas, elucidar los efectos catalíticos de las enzimas. Este video cubre cinética de la enzima y ensayos, pasar de un procedimiento general y mostrar algunas aplicaciones.

Las enzimas son proteínas o moléculas similares a proteínas que actúan sobre una molécula de reactivo, conocida como el substrato. Las enzimas reducen la energía de activación de reacciones bioquímicas. Esto permite que las reacciones que se producen a mayor velocidad con menos requisitos de energía.

Reacciones enzimáticas pueden dividirse en tres componentes elementales. La primera es la formación de la enzima-sustrato complejo, formado por la Unión del sustrato al sitio activo de enzima. El complejo puede descomponerse en sus componentes originales. Esta es la segunda reacción elemental. Alternativamente, el complejo puede formar el producto y recuperar la enzima, la tercera reacción elemental.

La cinética de una reacción elemental es dada por la ecuación de la ley de tasa primaria. Ecuaciones de la ley de velocidad dan la tasa en términos de la concentración de los reactivos y una constante de velocidad. Cada una de las reacciones elementales tiene una ecuación de la ley de tarifa por persona, con su propia constante de velocidad. Estas ecuaciones pueden ser destiladas a un modelo cinético que se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten. Esto le da la velocidad de reacción en términos de la concentración de sustrato; que puede ser determinada experimentalmente. Algunas tendencias generales de reacciones enzimáticas pueden ser identificados utilizando la ecuación de Michaelis-Menten. A concentración de sustrato alta, un punto de saturación se alcanza, llama Vmax. Aquí, la velocidad está limitada por la concentración total de enzima, y el número de moléculas de sustrato una enzima convierte en producto por momento, también conocido como kcat. De Michaelis-Menten cinética kcat es una de las dos constantes que rigen la velocidad de reacción. La constante KM, es conocida como la constante de afinidad. KM es también equivalente a la concentración donde la velocidad de reacción es equivalente a la mitad de la Vmax. Una enzima con una afinidad más alta tendrá una KM baja y llegar a la Vmax más rápido, mientras que una enzima con baja afinidad se tiene un alto KM y tardan más en llegar a la Vmax. Saber kcat y KM permite enzimas para compararse. Para ello utilizamos un ratio denominado eficiencia enzimática. Kcat mayor y menor KM como resultado una mayor eficiencia, menor kcat y más resultados KM en bajo.

Los factores utilizados para dilucidar la cinética de la enzima deben ser determinados experimentalmente. Estos ensayos se realizan típicamente mediante la mezcla de una solución de enzima y de sustrato en un ambiente controlado. Se realizan observaciones, midiendo los cambios en la concentración del sustrato, productos o subproductos con respecto al tiempo.

El cambio en la concentración con el tiempo se utiliza para determinar la velocidad de reacción. Para determinar la cinética, tarifa de datos se debe obtener en varias concentraciones. Si una parcela de la tasa inicial inversa vs concentración inicial inversa, conocido como el diagrama de Lineweaver-Burk, es lineal, entonces la reacción sigue la cinética de Michaelis-Menten. La pendiente y el intercepto de la línea permiten la determinación de los parámetros cinéticos KM y Vmax, que luego puede utilizarse para calcular kcat y la eficacia de la enzima.

Ahora que se han discutido los principios de la cinética de la enzima, echemos un vistazo a cómo se realiza un análisis de enzima típica.

En este procedimiento se demuestra un análisis colorimétrico. El primer paso es generar una curva estándar, que se correlaciona la absorbancia con la concentración de proteína. Soluciones de concentración conocida se preparan junto con una muestra de control. Se añade una solución de revelador que reacciona con la proteína diana para producir un compuesto coloreado. La absorbancia es medida y conspiró contra la concentración para generar la curva estándar.

Para realizar el ensayo, se prepara una concentración conocida de sustrato junto con la cantidad adecuada de enzimas. El enzima y el substrato se mezclan y permitió a incubar durante un intervalo de tiempo. pH y la temperatura se controlan con soluciones tampón y bloques de calefacción. Se agrega un agente de amortiguamiento para detener la reacción. Solución de revelado entonces se añade a las reacciones y mezclado. Las soluciones se colocan en cubetas y se mide la absorbancia. La cantidad de sustrato consumido se determina mediante la comparación de la absorbancia medida a la curva estándar. Utilizando los datos recogidos, se determinan velocidades de reacción inicial de concentración con el tiempo. Finalmente, con la tarifa de datos y la concentración, se hace la trama de Michaelis-Menten. Esto permite la determinación de las propiedades cinéticas de la enzima como número y enzima la eficiencia de facturación.

Ahora que hemos revisado un procedimiento de análisis, veamos otras formas se realizan ensayos y sus aplicaciones.

En este procedimiento traste análisis se utilizan para estudiar la cinética de una proteasa hidrolizando un enlace peptídico de una proteína. Estas emisiones pueden medirse, lo que permite un análisis continuo y cuantitativo de la producción y el consumo de sustrato, ayudar en la determinación de la cinética de la reacción.

Análisis de enzima se pueden utilizar en ciencias ambientales para determinar los niveles de actividad enzimática extracelular en el medio ambiente. Aguas, suelos y sedimentos pueden recogidos del ambiente y procesados en el laboratorio. Actividad enzimática extracelular de estos materiales se puede caracterizar entonces mediante pruebas enzimáticas. Se trata de una herramienta útil para la comprensión de cómo el medio ambiente procesos de material orgánico.

Mecanismo de reparación de ADN de una célula puede evaluarse mediante el estudio de la cinética de enzimas encontradas en el núcleo. La tasa en la que una enzima elimina daños, o lesiones del ADN puede medirse utilizando balizas moleculares fluorescentes, que sólo es fluorescente cuando ligada a secuencias de ADN únicas. El nivel de reparación del ADN se puede medir en tiempo real mediante la detección de los productos de fluorescencia marcado escote.

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JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Pruebas enzimáticas y cinética. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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