Reconstitución de proteínas de membrana

Biochemistry

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Summary

Reconstitución es el proceso de volver una biomolécula aislado a su forma o su función original. Esto es particularmente útil para el estudio de proteínas de la membrana, que permiten funciones celulares importantes y afectan el comportamiento de los lípidos cercano. Para estudiar la función purificada de proteínas de membrana in situ, debe ser reconstituidos por integrarlos en una membrana lipídica artificial.

Este video presenta la membrana proteína reconstitución conceptos y procedimientos relacionados, tales como aislamiento de proteínas con detergente, formación de vesículas artificiales con lípidos, incorporación de la proteína aislada en la vesícula artificial y separación del detergente de la solución. Por último, se cubren dos aplicaciones: reconstitución de proteínas de transporte de membrana y la reconstitución de proteínas recolección de luz.

Reconstitución es el proceso de restauración de una biomolécula aislado a su forma original o su funcionalidad. A menudo se utiliza este enfoque al estudio de proteínas de la membrana, que permiten muchos procesos celulares importantes y afectan el comportamiento de los vecinos de lípidos. Sin embargo, la complejidad del entorno celular dificulta la membrana funciones de la proteína a estudiar en situ. Las proteínas pueden extraerse y purificarse, pero sus funciones reales no pueden ser evaluados sin una membrana. Por lo tanto, las proteínas de membrana aislado son reconstituidos por integración en una membrana lipídica artificial, como un liposoma. Este video presenta los principios de la reconstitución de proteínas de membrana, un procedimiento de reconstitución general y unas cuantas aplicaciones en bioquímica.

Las membranas celulares consisten principalmente de fosfolípidos y proteínas de membrana. Los fosfolípidos forman una bicapa en la que las cabezas hidrofílicas de fosfato interactúan con el acuoso interior y exterior de la célula, mientras que las colas de ácidos grasos hidrofóbicos interactúan entre sí en la bicapa.

Algunas proteínas de la membrana sólo interactúan con la membrana por interacciones electrostáticas o no covalente. Otros, llamados 'proteínas integradas', se incrustan en la bicapa lipídica.

Como la bicapa proteínas integrales tienen extremos hidrofílicos y un centro hidrofóbico y se llevan a cabo en lugar por interacciones hidrofóbicas. Las proteínas integrales que abarcan la membrana entera se conocen como "proteínas transmembranales".

Las interacciones entre la membrana y estas proteínas son tan fuertes que incluso lisis de las células a no separarlos. Un surfactante especial llamado un detergente se utiliza para extraer las proteínas. Similar a los fosfolípidos, detergentes tienen cabezas hidrofílicas y colas lipofílicas y pueden entrar libremente en la membrana.

Dentro de la membrana, las colas lipofílicas del detergente interactúan con el núcleo hidrofóbico de la proteína. Esto rodea la proteína con una concha de las cabezas hidrofílicas de detergente, que interrumpen las interacciones proteína-lípido.

El complejo proteína-detergente ahora se separa fácilmente de la membrana. El detergente hace el complejo soluble en soluciones acuosas y listos para su reconstitución en una membrana artificial.

A menudo se reconstituyen las proteínas en las membranas de liposomas, que son vesículas artificiales. Para preparar liposomas, lípidos secados hidratados y agitados para inducir la formación de la vesícula. Cuando un detergente se agrega, se incorpora a las membranas de liposomas.

Para reconstituir la proteína, se combinan las proteínas solubilizadas y liposomas, y luego se elimina el detergente de la solución por diálisis o adsorción química. Las proteínas y liposomas rápidamente montan en proteoliposomes, tan sólo los grupos hidrofílicos están expuestos. Las proteínas funcionan entonces como en una membrana de la célula y puede ser investigados de manera aislada.

Ahora que hemos cubierto los fundamentos de la reconstitución de proteínas, vamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de la membrana en los liposomas.

Para comenzar a aislar las proteínas de membrana, las células son sometidas a lisis. Las células intactas se quitan con centrifugación.

El sobrenadante es centrifugado a una velocidad superior a las membranas de la pelotilla. El sedimento se suspende de nuevo y se añade un detergente para extraer las proteínas.

Los restos de células restantes se elimina por centrifugación adicional. La proteína es purificada del sobrenadante con cromatografía en columna y luego concentrada o purificada aún más según sea necesario.

Para comenzar a preparar los liposomas, una suspensión de fosfolípidos en solvente orgánico se seca bajo nitrógeno o argón.

Los fosfolípidos son hidratados con tampón de hidratación, y la mezcla se sonicó para terminar la creación de los liposomas.

Detergente se agrega para solubilizar los liposomas, que se combina con las proteínas.

El detergente se elimina luego por adsorción sobre granos del poliestireno, diálisis o de una columna de enlace de detergente. El proteoliposomes resultantes está listos para ser purificada y utilizada en experimentos posteriores.

Ahora que usted está familiarizado con los fundamentos de un procedimiento de reconstitución de proteínas de membrana, echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la reconstitución de proteínas en bioquímica.

Una proteína transportadora de membrana se reconstituyó para obtener una comprensión más clara de su mecanismo de transporte. Su reconstitución después de la función se verificó con un eflujo de iones yoduro. Luego, se estudió la actividad de transporte en presencia de diferentes inhibidores de molécula pequeña ion channel y potenciadotes. De esta manera, podrían estudiarse las interacciones directas de estas pequeñas moléculas con la proteína de transporte.

Clorofila y carotenoides-proteínas de membrana en plantas cosechan luz, promoción la separación del cargo y mitigación daños ligeros. Por reconstituir estas proteínas de recolección de luz, se pueden estudiar su dinámica y la interacción con pigmentos plegable. Las proteínas de recolección de luz reconstituidas con esta técnica tenían propiedades ópticas muy similares a las proteínas nativas. Espectroscopia de emisión de fluorescencia puede utilizarse entonces para estudiar la transferencia de energía de los pigmentos a las proteínas reconstituidas de recolección de luz.

Sólo has visto video de Zeus durante la reconstitución de proteínas de membrana. Reconstitución es una manera de transferir proteínas importantes para un imitador de celda para análisis adicionales. Este video cubre los principios de la reconstitución de proteínas, un protocolo de reconstitución y unas cuantas aplicaciones en bioquímica. ¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Reconstitución de proteínas de membrana. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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