电泳迁移分析法 (EMSA)

Biochemistry

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Summary

电泳迁移分析法 (EMSA) 是用来阐明蛋白质与核酸之间的绑定的生化过程。在这种测定方法中混合了放射性标记的核酸和蛋白质测试。绑定通过凝胶电泳分离组件基于质量、 电荷和构象。

该视频演示 EMSA 和一般的程序,包括凝胶和蛋白质的制备、 绑定、 电泳,检测的概念。覆盖在此视频的应用程序包括的染色质重塑的酶,包含 biontinylation,改性 EMSA 的分析与研究结合部位的细菌响应监管机构。

EMSA,电泳迁移分析法,也被称为凝胶转移检测,是一个多才多艺和敏感的生化过程。EMSA 通过检测转移乐队在凝胶电泳中阐明了蛋白质和核酸之间的绑定。

这个视频描述了 EMSA 的原则,所提供的一般过程,并探讨了一些应用程序。

DNA 复制、 转录、 和维修,以及 RNA 加工是所有关键的生化过程。他们都涉及到蛋白质与核酸之间的绑定。许多严重的疾病和障碍都与此绑定中修改。EMSA 是定性地确定是否某一特定蛋白绑定到特定的核酸技术。首先,核酸标记,通常与放射性磷-32,以创建探测器。然后测试蛋白质和核酸探针混合。当蛋白质与核酸探针结合时,由此产生的复杂有更大的质量和不同的构象比独自核酸。

绑定后,用凝胶电泳分析了配合物。在这种技术,电场力大分子通过凝胶基质迁移。组件单独的基于的质量、 电荷和构象。电泳法能从绑定探针分离蛋白-DNA 复合物。因为它们具有不同的群众和构象,他们将通过以不同的速率凝胶迁移和独立。分离很容易发现,由于放射性磷的存在,并证明了蛋白质成功绑定到给定的核酸。若要验证蛋白的鉴定,"supershift"使用免疫抗体与蛋白已知亲和力。这有进一步转移的复杂性,提高分辨率的额外的好处。

现在,我们已经看到的原则,让我们看看在实验室里。

开始执行程序,这种蛋白质必须隔离。为此,分子生物学技术用于表达蛋白在细胞中,然后净化。

核酸是放大和贴上标签,创建探测器。标签是通过培养 10 分钟完成与筒含放射性磷-32。辐射安全工作台和防护设备的要求。

然后制备凝胶。这种凝胶需要非变性,以防止改变构象和潜在解除绑定从探针在电泳过程中的蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶中长度有孔隙大小的 5 到 20 nm 和非常有用的短探针到 100 个碱基对。琼脂糖凝胶有 70 700 毫微米的孔径大小,可用于较大的探头。

蛋白质和核酸探针现在做好了准备,与我们进行绑定。三缓冲溶液编写和添加蛋白质和探针。Ph 值应该是类似于生理条件和盐浓度足以防止形成弱键与非靶核酸蛋白。使反应进行 20-30 分钟在 4 ° c。

下一步是电泳。利用低离子强度和 ph 值类似,在结合反应中使用的缓冲区。它产生一种"锁定效应",稳定配合物,增加流动性,减少产生的热量。后电泳,凝胶组分转移到滤纸上。在一个黑暗的房间里,过滤纸然后暴露电影。如果蛋白绑定到探头,两个不同的标记的区域将在转让中可见。一个表示复杂和一个单独的表示未绑定的探针。这种蛋白质成功绑定到核酸分离演示

现在,我们已经看到的基本程序,让我们看看一些应用程序。

染色质是紧凑的复杂的 DNA 和蛋白质发现真核细胞。染色质重塑酶修改要打开到转录 DNA 的结构。随着这变化的复杂流动性,可以用 EMSA 来探索结合活性的酶。

标签的另一种方法充分利用了甲基转移酶与 DNA 相互作用。可以修改辅助因子,以永久绑定到 DNA 甲基转移酶通过。而不是标签与磷-32,辅酶共轭与生物素结合,这是有利的因为它不是放射性。因为辅酶是特定于站点在其附件中,它是有关的基因分型、 甲基化检测和基因传递。Biotinilated 核酸通过紫外荧光进行检测。

当环境刺激激活组氨酸激酶时,磷酸化"反应调节"。这反过来将绑定到 DNA,影响转录,可通过 EMSA 研究。例如,表现出弧菌寻常型反应调节要绑定到感兴趣的基因。EMSA 用于验证绑定发生。

你刚看了朱庇特的视频上电泳迁移分析法。现在,您应该了解其原理的操作,其过程和其主要的操作参数中的步骤。

谢谢观赏 !

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 电泳迁移分析法 (EMSA). JoVE, Cambridge, MA, (2019).

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