Le retard sur gel (EMSA)

L’AESM, l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique, également connu sous le nom l’analyse de décalage de gel, est une procédure biochimique polyvalente et sensible. EMSA élucide la liaison entre les protéines et les acides nucléiques en détectant un changement dans les bandes en électrophorèse sur gel.

Cette vidéo décrit les principes de l’AESM, prévoit une procédure générale et traite de certaines applications.

Réplication de l’ADN, transcription et de réparation, ainsi qu’ARN est des processus biochimiques tout critiques. Ils sont tous impliquent la liaison entre les protéines et les acides nucléiques. Beaucoup de maladies graves et de troubles sont associés à des modifications dans cette liaison. L’AESM est une technique pour la détermination qualitative si une protéine spécifique se lie à un acide nucléique. Tout d’abord, l’acide nucléique est étiqueté, généralement avec le phosphore radioactif-32, pour créer une sonde. Ensuite, le test de protéine et acide nucléique sonde sont mélangés. Lorsqu’une protéine se lie à une acide nucléique de sonde, le complexe qui en résulte a une plus grande masse et une conformation différente que l’acide nucléique seul.

Une fois lié, les complexes sont analysés par électrophorèse sur gel. Dans cette technique, un champ électrique force macromolécules à migrer sur une matrice de gel. Les composants séparent sur la base de masse, charge et conformation. L’électrophorèse peut séparer des complexes protéine-ADN de sondes non liés. Puisqu’ils ont des conformations et masses différentes, ils migrent à travers le gel à des rythmes différents et séparés. La séparation est facile à déceler, grâce à la présence du phosphore radioactif et prouve que la protéine se lie avec succès à l’acide nucléique donné. Pour vérifier l’identification de la protéine, un « supershift » utilise un anticorps avec une affinité connue à la protéine. Cela a l’avantage supplémentaire de passer outre le complexe, en augmentant la résolution.

Maintenant que nous avons vu les principes, nous allons le voir dans le laboratoire.

Pour commencer la procédure, la protéine doit être isolée. Pour ce faire, des techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour exprimer la protéine dans les cellules et ensuite purifier.

L’acide nucléique est amplifié et étiqueté de manière à créer une sonde. L’étiquetage se fait grâce à une incubation de 10 min avec dCTP contenant du phosphore radioactif-32. Un rayonnement sécurisé établi et un équipement de protection sont requis.

Le gel est alors établi. Le gel doit être non dénaturants, afin d’empêcher la protéine altérant la conformation et potentiellement la séparation de la sonde pendant l’électrophorèse. Gels de polyacrylamide ont la taille des pores de 5 à 20 nm et sont utile pour les sondes courtes jusqu'à 100 paires de bases en longueur. Des gels d’agarose ont la taille des pores de 70 à 700 nm et sont utiles pour les sondes plus grandes.

Avec les protéines et les acides nucléiques sonde maintenant préparé, nous procédons à la liaison. Préparer une solution de tampon TRIS et la protéine et la sonde sont ajoutés. Le pH doit être similaire à des conditions physiologiques et concentration de sel suffisante pour empêcher la protéine formant des liaisons faibles avec des acides nucléiques non ciblés. La réaction se produit pendant 20-30 min à 4 ° C.

L’étape suivante est l’électrophorèse. Une zone tampon de faible force ionique et un pH identique à celui utilisé dans la réaction de liaison est utilisée. Il donne un « effet de mise en cage » qui stabilise complexes, augmente la mobilité et réduit la production de chaleur. Après électrophorèse, les composants du gel sont transférées sur du papier filtre. Dans une pièce sombre, le papier filtre est ensuite exposé au cinéma. Si la protéine se lie à la sonde, deux régions distinctes de marqués seront visibles dans le transfert. Représentant le complexe et une distincte représentant la sonde non liée. La séparation montre que la protéine a été liée à l’acide nucléique.

Maintenant que nous avons vu la procédure de base, nous allons étudier certaines applications.

La chromatine est le complexe serré de l’ADN et les protéines des cellules eucaryotes. Enzymes de remodelage de la chromatine modifient la structure pour ouvrir l’ADN à la transcription. Que cela change la mobilité du complexe, EMSA permet d’explorer l’activité de liaison de l’enzyme.

Une autre approche à l’étiquetage tire profit de l’interaction entre l’ADN et l’enzyme méthyltransférase. Un cofacteur peut être modifié pour lier en permanence à l’ADN par l’intermédiaire de methyltransferase. Au lieu de marquage avec le phosphore-32, le cofacteur est conjugué à la biotine, qui est avantageux, car il n’est pas radioactif. Parce que le cofacteur est spécifique au site dans son attachement, il est pertinent de génotypage, détection de méthylation et la livraison de gène. Les acides nucléiques de biotinilated sont détectés par fluorescence ultraviolette.

Lorsque les stimuli environnementaux activent kinases de l’histidine, un « régulateur de réponse » est phosphorylé. C’est à son tour lie à l’ADN, affectant la transcription, qui peut être étudiée par l’EMSA. Par exemple, un régulateur de réponse chez Desulfovibrio vulgaris a été démontré à lier le gène d’intérêt. EMSA a été utilisée pour vérifier que la liaison a eu lieu.

Vous avez juste regardé la vidéo sur l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique de JoVE. Vous devez maintenant comprendre ses principes de fonctionnement, les étapes de sa procédure et ses principaux paramètres de fonctionnement.

Merci de regarder !