Histotypic Gewebe-Kultur

Bioengineering

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Summary

Obwohl zweidimensionale Gewebekultur seit einiger Zeit üblich wurde, Zellen verhalten sich realistischer in einer dreidimensionalen Kultur, und mehr imitiert eng nativen Gewebe. Dieses Video stellt Histotypic Gewebekultur, wo das Wachstum und die Vermehrung von einer Zelllinie erfolgt in einer entwickelte dreidimensionale Matrix, hohe Zelldichte zu erreichen. Hier zeigen wir die Ernte der Zellen von Spendergewebe, gefolgt von Zellkultur auf ein veränderter Konstrukt.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Bioengineering. Histotypic Gewebe-Kultur. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Histotypic Gewebekultur können Zellen angebaut werden, in drei Dimensionen, wodurch es in-vitro-Gewebe Morphologien, die eng realistische Gewebefunktion zu imitieren, die als tragfähige Konstrukte für die Reparatur von Gewebe verwendet werden kann. Diese Kulturen sind in der Regel drei dimensionale Strukturen bestehend aus einem einzigen Zelltyp in hoher Dichte angebaut. Die dreidimensionale Struktur, auch bekannt als das Gerüst, ahmt die natürliche extrazelluläre Matrix. Je nach Zelltyp verwendet Gerüste können für eine bestimmte Anwendung ausgelegt werden und in der Regel als Vorlage für Bio-mimetischen Gewebe handeln. Dieses Video zeigt die Grundlagen der Histotypic Gewebekulturen, ein Verfahren zur Isolierung von Zellen, und Herstellung und Cellularization von einem porösen Seide Gewebe Gerüst, um Herzgewebe zu imitieren.

Alle Gewebe bestehen aus zwei grundlegenden Komponenten, die extrazelluläre Matrix und die gewebespezifische Zellen, die sie bewohnen. Die extrazelluläre Matrix ist ein Netzwerk von Strukturproteinen, die drei erstellen dreidimensionale Umgebung für Zellen, um zu besetzen, und die Zellen in ihm sollen die native physiologischen Prozesse des Gewebes zu rekapitulieren. Derzeit ist eine gängige Technik genutzt, um Modell Gewebe zwei dimensionale Gewebekultur, wo Zellen verzichtet auf einen flachen Untergrund und bilden einen dünnen Film durfte. Im Allgemeinen ist diese Methode nicht zuverlässig für die Aufrechterhaltung einer in-vivo Phänotyp, Organ-spezifischen Funktionen und Zelle oder Zellen auf Substrat kontextuellen Interaktionen. Histotypic Gewebekultur lindert diese Einschränkungen durch die Bereitstellung einer 3D Gerüst für die Zellen auf, wachsen führt ein dichtes Netz von Zellen, die genauer imitiert native Zelle Morphologien und erleichtert die Entwicklung von realistischen interzellulären Netzwerke und Kommunikationswege. Eine Vielzahl von 3D Polymer-Netzwerken, einschließlich Hydrogele und Electrospun seidene Matten bieten praktische Kultur gewebespezifische Zellen in drei Dimensionen. Um diese Gerüste aufzufüllen, müssen die Zellen isoliert werden. Primärzellen verwendet in diesem Video sind von lebender Gewebe geerntet, die gehackt und dann verdaut in einer Enzymlösung, die Ziel-Zellen aus der extrazellulären Matrix zu trennen. Sobald die Zellen isoliert sind, gibt es zwei Techniken verwendet, um die Gerüste zu säen. Tröpfchen bei dieser Technik wird eine Lösung von Zellen auf das Gerüst mit einer langsamen und konstante Rate pipettieren. Die zweite oder Zelle Aussetzung Technik, taucht das Gerüst in eine Zellsuspension. Oft sind das Gerüst und die geschüttelt, um die Zellwanderung in die Matrix zu fördern. Beide Techniken führen Bio-engineered Konstrukte mit hohen Zelldichten. Die folgenden Verfahren beinhalten die Isolation der Herzmuskelzellen und die Zelle Aussetzung Technik um eine kardiale zellspezifische Gerüst zu erstellen, wie es die Einheimischen Herz Gewebe Morphologie zu behalten.

Um den Prozess der Isolierung der Zellen von Spendergewebe beginnen, starten Sie indem Sie sicherstellen, dass die Arbeit Bereich und Dissektion Instrumente sterilisiert werden. Legen Sie ein steriles Tuch auf der Arbeitsfläche in der Bio-Sicherheitsschrank. Platzieren Sie die sterilen chirurgischen Instrumente auf den Faltenwurf zu, ohne sie zu berühren, und öffnen Sie eine sterile Nummer 20 Skalpellklinge. Sterilisieren Sie nach der Probe euthanizing den OP-Bereich mit einem Betadine-getränkten Tupfer. Wenn Sie bereit sind, sichern Sie die Probe und beginnen Sie den chirurgischen Eingriff, um das Gewebe des Interesses zu isolieren. In diesem Fall werden die Herzen. Sobald herausgeschnitten, legen Sie das Gewebe auf dem Eis in der Petrischale, PBS Glukose enthält. Entfernen Sie alle verbleibenden Blut oder Bindegewebe, und übertragen Sie dann das Gewebe auf eine Petrischale mit frischen PBS Glukose. Dann, mit sterilem Mikro-Schere und Pinzette, sorgfältig die Gewebeproben in etwa 1 Kubikmillimeter Stücke hacken. Mit einer Pipette, die Stücke und Puffer auf eine konische Rohr übertragen. Dann entfernen Sie alle 10 Milliliter des Puffers. Fügen Sie 7 Milliliter Kollagenase-Lösung hinzu, und dann schütteln Sie die Mischung für 7 Minuten bei 37 Grad Celsius. Dann sanft pipette 10mal, um die Gewebe-Stücke zu brechen. Lassen Sie die Stücke zu begleichen, und dann die Flüssigkeit abzusaugen und entsorgen Sie sie. Anschließend wiederholen Sie die Verdauung und pipette vorsichtig die Lösung für die Gewebe-Stücke brechen. Nach die Stücken beglichen sind, der Überstand abziehen und in einem separaten 50 ml konische Rohr zu sammeln. Fügen Sie 10 ml Stopp-Lösung zu jedem konischem Rohr mit Überstand um die Verdauung zu stoppen.

Nun, da die primäre Zellen isoliert wurden, nehmen wir fertigen leski poröse Seide Gewebe. Um zu beginnen, Gießen Sie 30 Milliliter der Seide-Lösung in eine Form. Streuen Sie 60 Gramm gesiebtes Natriumchlorid anschließend gleichmäßig über die Lösung. Führen Sie die Seide zu polymerisieren ungestört bei Raumtemperatur für 48 Stunden. Legen Sie dann die Form in einem 60 Grad-Ofen für 1 Stunde abzuschließen, Vernetzung und jede restliche Flüssigkeit verdampfen. Sobald polymerisiert, Tauchen Sie die Form in ein Becherglas von destilliertem Wasser für 48 Stunden, um das Salz zu schmarotzen. Dann entfernen Sie das Gerüst aus der Form und schneiden Sie kleine Scheiben, die mit einer 5 Millimeter-Biopsie Punsch. Schneiden Sie die Scheiben bis zu einer Höhe von 2 Millimeter, und entfernen Sie schließlich die Zentren der jedes Stück mit einem 2 mm Biopsie Schlag um einen Ring zu erstellen. Zu guter Letzt Autoklaven die Gerüste in einem nassen Zyklus für 20 Minuten.

Mit dem Gerüst vorbereitet beginnen wir die Zelle Aussaat Prozess. Zunächst legen Sie ein steriles Gerüst pro Bohrloch in einer 96-well-Platte. Fügen Sie Zellkulturmedium um Tauchen die Gerüste und Inkubation bei 37 Grad Celsius in einer Gewebekultur Inkubator zu ihnen für mindestens 30 Minuten equilibrate. Aspirieren Sie nach Inkubation die überschüssigen Mittel und fügen Sie dann die isolierten Primärzelle Aussetzung, die Gerüste. Als nächstes die Platte in den Inkubator zurück und lassen Sie über Nacht für die Zellen an den Gerüsten befestigen. Am nächsten Morgen vorsichtig Aspirieren der fraktionslosen Zellen und ersetzen mit 200 Mikroliter Frischzellen-Kulturmedium pro Bohrloch. Die daraus resultierende Gerüst ist eine poröse Konstrukt mit einer hohen Zelldichte verwendet werden.

Nun, da Sie gelernt haben, führen Sie Histotypic Gewebekultur, betrachten wir einige praktischen Anwendungen dieser Materialien. Histotypic Gewebekultur können zelluläre Mikro-Umgebungen erstellen, die nativen Gewebe zu imitieren, und sind dadurch in der Lage, ein geeignetes Modell für die Erforschung der zellulären Verhalten über eine einzelne Zelle Art zu bieten. Beispielsweise kann 3D Faser in Gerüste, die genauer der Stammzellnische gefunden in-vivo imitieren, mit pluripotenten Stammzellen für biologische Signale und bestimmen deren Auswirkungen auf die Stammzelldifferenzierung ausgesät werden. Diese Arbeit kann letztlich bieten ein besseres Verständnis der wie Stammzellen differenzieren und Einblicke in die Zelldifferenzierung und Regeneration für Tissue-engineering-Anwendungen bieten kann. Wie dynamische Kulturen kann mechanische Klimaanlage auch verbessern das 3D Gewebe Gerüst von verschiedenen mechanischen Belastungen, die natürliche Gewebe in Vivo auftreten können zu unterwerfen. Durch Kompression und biaxialen Lasten während Zellwachstum, wird Zellmorphologie und extrazellulären Matrix geändert, um die mechanischen Belastungen widerspiegeln. Dies führt zu leska vorkonditionierten Bio-engineered Gewebe mit einer zellulären Struktur ähnlich nativen Gewebe, wodurch es ideal für die Implantation in Bereichen, die ähnliche mechanische Kräfte auftreten können. Schließlich können auch technische Gewebe Konstrukte verwendet werden, zu ersetzen oder zu reparieren Gewebedefekte. Um dies zu erreichen, muss das Gewebe Gerüst zuerst durchblutet werden wodurch Blut durch das Konstrukt frei bewegen. Sobald durchblutet, kann das Gerüst übertragen und implantiert in den Gewebe-defekt Reparatur einzuleiten. Erfolgreiche Transplantation kann später durch Histologie, bestätigt werden welche zeigt, ob das Gewebe vollständig konstruieren, die schadhafte Stelle repariert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Gewebekultur Histotypic beobachtet. Sie sollten jetzt wissen, wie einfache 3D Strukturen sind bereit, wie primäre Zellen isoliert und auf einem Gerüst und die verschiedenen Anwendungen dieser Kulturen im Bereich Bio-Engineering ausgesät. Danke fürs Zuschauen.

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