Overview
Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Bradley Schmitz
Pilze sind Heterotrophe eukaryotische Organismen, und mit Ausnahme von Hefen sind aerob. Sie sind reichlich in Oberböden und sind wichtig für ihre Rolle in der Nährstoffkreisläufe und die Zersetzung von organischen Stoffen und organischen Verunreinigungen. Weiße Fäule Pilze (Phanerochaete Chryosporium) z. B. (Abbildung 1) bekanntermaßen Aromaten zu degradieren.
Abbildung 1. Fäulnis auf Birke weiß.
Principles
Böden enthalten in der Regel Millionen Pilze pro Gramm, so dass der Boden in der Regel verdünnt wird mit Hilfe einer Verdünnungsreihe. Eine Verdünnungsreihe erfolgt dadurch, dass eine bestimmte Menge an Boden bei einer Dispergier-Lösung wie deionisiertes Wasser. Die Aliquote der Suspensionen werden frische Lösung übertragen bis die Suspension ausreichend verdünnt wird, um einzelne diskrete pilzartige Kolonien auf Agarplatten wachsen zu lassen. (Abbildung 2)
Nach der Inokulation auf mehrere replizieren Agarplatten werden die Platten bei 25 ° c inkubiert. Nachdem die makroskopischen pilzartigen Kolonien gebildet sind, werden sie gezählt, wie in Abbildung 3dargestellt. Denn es davon ausgegangen wird, dass eine pilzartige Kolonie ist abgeleitet von einem Organismus, der Begriff Kolonie Bildenden Einheiten (KBE) in der abschließenden Analyse verwendet wird, mit den Resultaten ausgedrückt KBE pro Gramm Ofen trocknen Sie Boden.
Normale kultivierbare Pilze Grafen aus fruchtbaren Boden sind im Bereich von 106-106 Pilz "Brutkörper" (hyphal Fragmente, Sporen oder Hyphen) pro Gramm trockenen Boden. Kultivierbare Platte Grafen wurden zum Auflisten von Organismen seit dem 19. Jahrhundert gebräuchlich. Sie weiterhin heute verwendet werden, wie sie kostengünstig sind zu führen, erfordert wenig Arbeit, sind schnell und relativ reproduzierbar sind. Allerdings leiden sie an einer Anzahl von Fehlern, die bei der Bewertung der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. Die bedeutendste dieser Fehler ist die Tatsache, die viele Organismen nicht auf Medien Platten Kultur werden.
Abbildung 2: Verdünnung und Galvanik Technik. Hier die verdünnte Boden Aussetzung fließen direkt in das Agar-Medium anstatt Oberfläche angewendet wie im Falle der Verbreitung Beschichtung. Von Environmental & Verschmutzung Wissenschaft, 2Nd Ed., Academic Press, San Diego, CA
Abbildung 3. Beschmutzen Sie Pilze isoliert von einer Oberfläche des Bodens in einer Petrischale mit Rose Bengal Agar gewachsen. Foto mit freundlicher Genehmigung k.l. Josephson. Von Environmental & Verschmutzung Wissenschaft, 2Nd Ed., Academic Press, San Diego, Kalifornien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. Boden Probenvorbereitung
- Ermitteln Sie zunächst den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt des Bodens durch über Nacht trocknen von einer bekannten Menge des feuchten Bodens und Gegengutachten die getrockneten Boden. Die Gleichung den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt des Bodens zu bestimmen ist:
(Gleichung 1)
Wo:
MC = Feuchtigkeitsgehalt
W = Nettogewicht
D = Trockengewicht - Berechnen Sie die Menge des Wassers, die 25 g des Bodens erhöhen die Bodenfeuchte, 10 % auf einer trockenen Gewicht-Basis hinzugefügt werden muss.
- Fügen Sie diese Menge an Wasser, 25 g des Bodens.
- Decken Sie den Container mit Plastikfolie und Punktion des Films mehrmals mit einer Sonde zur Belüftung während der Inkubation zu ermöglichen. Befestigen Sie den Film mit einem Gummiband.
- Wiegen des Bodens und wickeln, dann eine Woche Probe bei Raumtemperatur inkubieren.
(2) Pilz Impfung und Inkubation
- Nach die Inkubation abgeschlossen ist, wiegen Sie die Bodenprobe mit Wrap und Gummiband. Berechnen Sie die Gewichtsabnahme durch den Feuchtigkeitsverlust von.
- Berechnen Sie die neue Bodenfeuchte.
- Als nächstes bereiten Sie eine Reihe von 1/10-Verdünnung der Böden wie in Abbildung 2dargestellt. Dadurch werden Verdünnungen von 10-1 (a-Flasche), 10-2 (Rohr B), 10-3 (Rohr C), 10-4 (Rohr D) und 10-5 (Rohr E) g Erde pro mL Suspensionen.
- Bereiten Sie sterile Rose Bengal-Streptomycin Agarplatten. Die Rose Bengal und Streptomycin hemmen Wachstum von Bakterien. Für sehr fruchtbaren Böden, wo Boden mikrobiellen Populationen hoch sind, die gewählten Verdünnungen sollte höher sein, d.h., 10-310-4und 10-5g Boden pro Platte.
- Zu jedem der 10-3 Platten, fügen Sie 0,1 mL Verdünnung Röhre 10-2und Verbreitung über die Agar-Oberfläche mit einer Ethanol-Flamme sterilisiert Glas Streuer. Weil eine Menge von 0,1 mL überzogen ist, macht dies die effektive Verdünnung 10-3. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Verdünnungen.
- Eine Woche inkubieren Sie Platten bei Raumtemperatur.
(3) Koloniezahlbestimmung und Prüfung durch Mikroskopie
- Kolonie zählt nur eine Verdünnung von jeder Boden zu machen. Die Platten, die gezählt werden sollte diskrete zählbare Kolonien haben. Überwucherte Platten sollten nicht gezählt werden. Ebenso sollten die Platten mit weniger als 10 Kolonien nicht gezählt werden. Beachten Sie, und beschreiben Sie die kulturellen Besonderheiten von drei verschiedenen Kolonien zu.
- Detaillierten Mikroskop Studie mithilfe des folgenden Verfahrens bereiten Sie Druck Klebeband (Tesafilm) Halterungen auf Folien vor:
- Hinterlegen Sie einen Tropfen Flüssigkeit in der Mitte des einen sauberen Objektträger Montage lactophenol
- Schneiden Sie einen Streifen von klaren Tesafilm etwa 3 cm lang aus dem Lager Rollen. Zur Vermeidung einer Kontamination der Klebefläche, verwenden Sie Zange beim Umgang mit des Bands. Sezierenden Nadel wird helfen, das Band von der Zange zu befreien.
- Die klebende Seite des Bandes wird die Oberfläche einer sporulating Pilz-Kolonie. Achten Sie darauf, übermäßigen Druck auf das Band oder zu dicht, eine Masse von Hyphen und Sporen werden gesammelt.
- Entfernen Sie das Klebeband vom Kontakt mit der Pilz-Kolonie und wenden sie, Klebeseite nach unten, bis die Tropfen Flüssigkeit auf den Objektträger zu montieren. Das Band mit einer glatten, flachen Instrument zur ausdrücklichen Luftblasen einmassieren.
- Prüfen Sie die Band Mount mikroskopisch unter dem Öl-Immersion-Ziel mit Öl.
- Identifizieren Sie zwei verschiedene Pilz-Gattungen mit den mitgelieferten Pilz Identifikationsschlüssel (Abbildung 4).
Abbildung 4. Pilz Identifikationsschlüssel.
Filamentöse Pilze sind mehrzelligen, eukaryotische Organismen, die oft in großer Zahl im Boden, eine wichtige Rolle im Ökosystem gefunden. Pilze können isoliert, quantifiziert und im Labor untersucht werden.
Pilze sind reichlich in Oberböden und führen wichtige Rollen in Nährstoff Radfahren und Zersetzung von organischen Stoffen und Verunreinigungen. Nicht in der Lage, ihre eigene Nahrung zu synthetisieren ist als Heterotrophe eingestuft und sind aerobe und erfordern daher Sauerstoff.
Kultur-Pilze, Boden Proben sind bekannte Konzentrationen in sterilem Wasser verdünnt, dann vernickelt auf Agarplatten und inkubiert. Die daraus resultierende pilzartigen Kolonien können dann gezählt und identifiziert werden.
Dieses Video wird die Grundsätze hinter der Isolierung, Quantifizierung und Identifizierung von filamentösen Pilzen zu veranschaulichen.
Millionen von Pilzen pro Gramm enthalten in der Regel Böden; Daher sind Verdünnungsreihen gebräuchlich, Bodenproben zur Analyse vorzubereiten. Eine bestimmte Menge an Boden wird eine Dispergierung Lösung hinzugefügt. Aliquote der Suspension werden in einer Pufferlösung in Serie übertragen, bis die Suspension verdünnt ist genug, um diskret pilzartige Kolonien wachsen zu lassen.
Diese Verdünnungen sind dann vernickelt auf Agar-Medien und inkubiert. Sobald sie sichtbare pilzartige Kolonien gebildet haben, können sie gezählt werden. Da davon ausgegangen wird, dass ein einziger Organismus jede pilzartige Kolonie abgeleitet ist, wird der Begriff Kolonie Bildenden Einheiten oder KBE, verwendet, die Anzahl der Organismen berechnet pro Gramm trockene Erde zum Ausdruck zu bringen.
Die meisten Pilze wachsen als Hyphen, die sind lang, Verzweigung Strukturen, die den Hauptmodus des vegetativen Wachstums sind. Aggregationen von Hyphen sind als Myzel bezeichnet. Pilze können auch als einzellige Organismen, mit Hefe wird ein weithin bekanntes Beispiel vorhanden sein.
Pilz Reproduktion kann auf mehrere Arten auftreten. Hyphen-produzierende Pilze können ungeschlechtlich, durch Fragmentierung Hyphen oder von Stielen mit Samen-wie Sporen vermehren. Einzellige Pilze können asexuell durch Knospung vermehren.
Pilze können auch sexuell reproduzieren. Dies ist weniger verbreitet als asexuelle Reproduktion und tritt in der Regel als Reaktion auf ungünstige Umweltbedingungen. In der Herstellung von Hyphen Pilze, zwei reproduktiven Hyphen aus verschiedenen Pilzstämmen können verschmelzen, Erstellung einer Zygote. In einzelne einzellige Pilze werden zwei Zellen von anderen Stämmen verschmelzen.
Fruchtbare Böden enthalten in der Regel im Bereich von 106 Pilz "Einsammlung" pro Gramm Trockengewicht. Brutkörper sind Pilzsporen, Hyphen oder hyphal Fragmente. Mit kultivierbarer Platte zählt, ist eine schnelle, kostengünstige und reproduzierbare Technik, Pilz Inhalte aufzuklären. Ergebnisse können jedoch durch die Tatsache verzerrt werden, die nicht alle Organismen auf Medien Platten Kultur werden.
Rose-Bengal Agarplatten mit Antibiotika wie Streptomycin, dienen in der Regel für Pilzkulturen. Da Bakterien viel zahlreicher als die Pilze in den meisten Böden sind, wählt die ideale Pilzen Medien gegen Bakterienwachstum und gleichzeitig die Pilze zu überleben. Rose-Bengal Farbstoff hemmt das Wachstum der meisten Bakterien und reduziert die Größe der pilzartige Kolonien. Dies ist ideal, und verhindert übermäßiges Wachstum von Pilz Platten sowie controlling Bakterien.
Nun, da wir die Prinzipien hinter Kultivierung filamentöse Pilze kennen, werfen Sie einen Blick auf wie dies im Labor durchgeführt wird.
Sobald die Bodenproben gesammelt haben, bringen sie in das Labor zur Analyse. Berechnen Sie zunächst, den Feuchtigkeitsgehalt des Bodens. Fügen Sie deionisiertes Wasser um den Feuchtigkeitsgehalt auf 15 % zu bringen.
Die Behälter mit Plastikfolie abdecken und sichern mit einem Gummiband um Verdunstung zu begrenzen. Punktion des Films mehrere Male Belüftung zu ermöglichen.
Wiegen Sie die Bodenprobe und Container und Rekord. Inkubation bei Raumtemperatur für eine Woche, damit Wachstum der natürlich vorkommenden Pilze.
Wägen Sie die Bodenproben und Container neu ab und nehmen Sie das Gewicht. Gewichtsverlust durch den Feuchtigkeitsverlust von im Laufe der Woche zu berechnen. Fügen Sie Wasser auf den Boden, um das Gewicht wieder auf den ursprünglichen Wert zu bringen.
10 g für feuchten Boden zu 95 mL destilliertem Wasser hinzufügen und gut mischen. Dies ist die 10-1 -Verdünnung, da 10 g des Bodens ein Volumen von etwa 5 mL hat. Führen Sie vier serielle Verdünnungen von 1 mL zu 9 mL Rohlingen mit Wasser aus dieser Stammlösung.
Als nächstes sammeln Sie acht sterile Rose-Bengal-Streptomycin Agarplatten. Zwei der Platten fügen Sie 0,1 mL Verdünnung Röhre 10-2und verteilt die Agar-Oberfläche mit einem Ethanol-Flamme sterilisiert Glas Streuer. Weil eine Menge von 0,1 mL überzogen ist, macht dies die effektive Verdünnung 10-3.
Eine Woche inkubieren Sie diese Platten in einem dunklen Schrank bei Raumtemperatur.
Zählen Sie nach einer Woche die diskrete Kolonien auf jeder Platte. Platten mit 10 bis 20 pilzartige Kolonien sollten gezählt werden. Beachten Sie und beschreiben Sie Unterscheidungsmerkmale von Platten oder Kolonien zu.
Nehmen Sie einen sauberes Glas-Objektträger und hinterlegen Sie einen Tropfen Lactophenol Montage Flüssigkeit in die Mitte zu. Zange schneiden zur Vermeidung von Kontaminationen, Sie einen Streifen von klaren Tesafilm etwa 3 cm lang. Verwenden Sie ggf. eine sezierenden Nadel, um das Band von der Zange zu befreien.
Wenden Sie die Klebeseite des Bandes an der Oberfläche einer sporulating Pilz-Kolonie, kümmert sich um Überdruck zu vermeiden. Als nächstes wenden Sie die klebende Seite des Bandes mit Spore Probe auf die Montage-Flüssigkeit auf dem Objektträger. Reiben Sie das Band vorsichtig mit einer glatten, flachen Instrument, um Luftblasen zu entfernen.
Anbauträger Band unter einem leistungsstarken Objektiv zu prüfen.
Pilze können durch Prüfung der Fruchtkörper und Sporen mikroskopisch identifiziert werden. Ein Pilze Identifikationsschlüssel kann diesen Prozess unterstützen. Gängigen Pilze beobachtet gehören Penicillium und Aspergillus.
Unter Verwendung der Platten, können die Pilze mit der gleichen Technik wie bei bakteriellen Enumeration aufgelistet werden.
Identifizierung und Kultivierung von Pilzen eignet sich für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Anwendungen.
Branchen wie Papier- und Herstellung von Anlagen können filamentöse Pilze verwenden, um Holz in ihrem besonderen Prozess in einer Technik bekannt als Biopulping zu degradieren. Pilze wie weiß-Rot können Hackschnitzel effizient, sich verschlechtern, führt zu verringerte Notwendigkeit für den Einsatz von chemischen oder mechanischen zerdrücken.
Pilze können auch zum Abbau von anderen Materialien, einschließlich bestimmter Arten von biologisch abbaubaren Kunststoffen verwendet werden. Dies kann nützlich sein für Landwirtschaft oder Gärtnerei Anwendungen, wo möglicherweise biologisch abbaubarer Mulchfolien verwendet werden, um temporäre Hindernisse für unerwünschte Pflanzenwachstum zu schaffen.
Pilze sind auch Produzenten von Antibiotika, Verbindungen, die Medizin des 20. Jahrhunderts revolutioniert und weiterhin eine Frontlinie Verteidigung in Infektion heute sein. Penicillin, eine weit verbreitete Antibiotikum wurde isoliert aus der gemeinsamen filamentöse Pilze Penicillium Rubens. Filamentöse Pilze sind bis zum heutigen Tag immer noch isoliert und studierte bei der Suche nach neuen Antibiotika.
Sie habe nur Jupiters Einführung in filamentöse Pilze beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wie man Kultur filamentöse Pilze aus dem Boden, wie sie zu quantifizieren und Pilzarten allgemein gefunden im Boden zu identifizieren. Danke fürs Zuschauen!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Kolonie zählt
Die Anzahl der pilzartige Kolonien pro Gramm Boden ist gleich der Anzahl der Kolonien auf der Platte, multipliziert mit der Kehrwert der Verdünnung überzogen gezählt. Beispielsweise wenn bei einer Verdünnung von 10-546 Kolonien gezählt werden, dann die KBE pro Gramm Boden ist 46 x 105 oder 4.6 x 106.
Identifizierung von drei verschiedenen Pilz-Gattungen
Pilze können durch Prüfung der Fruchtkörper und Sporen mikroskopisch identifiziert werden. Ein Pilze Identifikationsschlüssel kann diesen Prozess unterstützen. (Abbildung 4) Gängigen Pilze beobachtet gehören Penicillium und Aspergillus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Verdünnung und Beschichtung von Bodenpilzen können als Indikator für die Gesundheit des Bodens verwendet werden. Normalerweise wird ein "gesunder" fruchtbaren Boden haben 105 106 Pilze pro Gramm Boden. Es kann auch verwendet werden, um Reinkulturen von bestimmten Pilzen, anschließend ausgewertet für bestimmte Eigenschaften, z. B. die Fähigkeit, organische Verbindungen zersetzen zu isolieren. Diese können wie im Fall von Weißfäule-Pilze schädlich sein, oder vorteilhaft, wenn toxische organische Stoffe werden abgebaut durch biologischen Abbau. Andere Verwendungen von Reinkulturen von Pilzen gehören die Isolation von Pilzen für Antibiotika. Beispielsweise war das erste Antibiotikum Penicillin, produziert durch bodenbürtige Pilz Penicillium. Dies wurde erstmals von Sir entdeckt. Alexander Fleming im Jahr 1929.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
