Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz
Hongos son organismos eucariotas heterótrofos y con la excepción de levaduras, son aerobios. Son abundantes en suelos superficiales y son importantes para su papel en el ciclo de nutrientes y la descomposición de materia orgánica y contaminantes orgánicos. Blanco hongos (phanerochaete chryosporium) por ejemplo, (figura 1) se saben para degradar compuestos aromáticos de putrefacción.
Figura 1. Blanco rot en abedul.
Principles
Suelos generalmente contienen millones de hongos por gramo, por lo que el suelo se diluye normalmente con una serie de diluciones. Una serie de dilución se hace suspendiendo una cantidad dada de suelo en una solución dispersante, como agua desionizada. Las alícuotas de las suspensiones se transfieren a una solución fresca, hasta que la suspensión se diluye suficientemente para permitir colonias fúngicas discretas individuales que crecen en las placas de agar. (Figura 2)
Después de la inoculación en placas de agar replicar varias, las placas se incuban a 25 ° C. Después se forman las colonias de hongos macroscópicas, cuentan, como se muestra en la figura 3. Porque el supuesto es que una colonia de hongos se deriva de un organismo, el término Unidades formadoras de colonias (UFC) se utiliza en el análisis final, con los resultados expresados en términos de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo seco de horno.
Cuentas normales de hongos cultivables de suelo fértil están en el rango de 106-106 hongos "propágulos" (esporas, hifas y fragmentos hyphal) por gramo de suelo seco. Cuenta de placa cultivables ha sido en el uso de la enumeración de los organismos desde el siglo XIX. Se siguen usando hoy en día, como son realizar, requieren poca mano de obra baratas, son rápidas y son bastante reproducibles. Sin embargo, sufren una serie de errores, que deben ser consideradas al evaluar los resultados. El más importante de estos errores es el hecho de que muchos organismos no se cultivo en las placas de los medios de comunicación.
Figura 2. Dilución y la técnica de la galjanoplastia. Aquí, la suspensión de suelo diluido se incorpora directamente en el medio de agar en lugar de ser superficie aplicada como en el caso de la galjanoplastia de la propagación. De ambiental & contaminación ciencia, 2nd Ed., prensa académica, San Diego, CA
Figura 3. Hongos aislados de un suelo superficial en una placa Petri conteniendo Agar de Bengala Rose del suelo. Foto cortesía de K.L. de Josephson. De ambiental & contaminación ciencia, 2nd Ed., prensa académica, San Diego, CA.
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Procedure
1. preparación de la muestra de suelo
- En primer lugar, determinar el contenido de humedad inicial del suelo durante la noche secando de una cantidad conocida de suelo húmedo y pesajes el suelo seco. La ecuación para determinar el contenido de humedad inicial del suelo es:
(Ecuación 1)
donde:
MC = contenido de humedad
W = peso neto
D = peso seco - Calcular la cantidad de agua que debe agregarse a 25 g de suelo para aumentar el contenido de humedad al 10% sobre una base de peso seco.
- A continuación, añadir que la cantidad de agua a 25 g de suelo.
- Cubra el envase con envoltura de plástico y perforar la película varias veces con una sonda para permitir la aireación durante la incubación. Fije la película con una banda elástica.
- Pesar el suelo y envolver, luego incubar la muestra a temperatura ambiente durante una semana.
2. incubación e inoculación de hongos
- Una vez finalizada la incubación, pesar la muestra de suelo con la goma y el plástico. Calcular la pérdida de peso debido a la pérdida de humedad.
- Calcular el contenido de humedad de suelo nuevo.
- A continuación, preparar una dilución al 1/10 serie de los suelos tal como se muestra en la figura 2. Esto resultará en diluciones de 10-1 (frasco A), 10-2 (tubo B), 10-3 (tubo C), 10-4 (tubo D) y 10-5 (tubo E) g suelo por suspensiones de mL.
- Preparación estéril Rose Bengal-estreptomicina placas de agar. El rosa Bengala y la estreptomicina inhiben el crecimiento bacteriano. Para terrenos muy fértiles donde las poblaciones de microbios del suelo son altas, las diluciones solicitadas deben ser mayores, es decir, 10-3, 10-4y 10-5, g de suelo por placa.
- A cada uno de los 10-3 placas, Añadir 0,1 mL de dilución tubo 10-2, y extensión sobre la superficie del agar utilizando una llama de etanol esterilizado separador de vidrio. Porque una cantidad de 0,1 mL es plateada, esto hace que la efectiva dilución 10-3. Repita estos pasos para todas las diluciones.
- Incubar las placas a temperatura ambiente durante una semana.
3. Colonia contando y el examen por microscopia
- Realizar recuentos de colonias en la dilución una y sólo una de cada suelo. Las placas que se cuentan tengan colonias contables discretas. No deben contarse los platos demasiado grandes. Asimismo, no deben contar las placas con menos de 10 colonias. Observar y describir las características culturales de tres colonias diferentes.
- Preparar montajes de cinta (tape transparente) de presión en las diapositivas para estudio detallado microscopio siguiendo el siguiente procedimiento:
- Depositar una gota de lactofenol montaje fluido en el centro de un portaobjetos de vidrio limpio
- Corte una tira de cinta de celofán transparente unos 3 cm de largo de la lista acciones. Para evitar contaminar la superficie adhesiva, usar pinzas al manipular la cinta. Una aguja de disección ayudará a liberar la cinta de los fórceps.
- El lado adhesivo de la cinta se aplica a la superficie de una colonia de hongo de esporulación. Tenga cuidado para evitar una presión excesiva sobre la cinta o una masa muy densa de hifas y las esporas serán recogidas.
- Retire la cinta de contacto con la colonia de hongos y aplicarlo, lado adhesivo hacia abajo, a la gota de líquido de montaje sobre el portaobjetos de cristal. Frote suavemente la cinta con un instrumento liso, plano para burbujas express.
- Examinar el cinta montaje microscópico con el objetivo de inmersión de aceite con aceite.
- Identificar dos géneros diferentes de hongos usando la clave de identificación de hongos suministrados (figura 4).
Figura 4. Clave de identificación de hongos.
Hongos filamentosos son organismos multicelulares, eucariotas, a menudo se encuentran en grandes cantidades en el suelo, desempeñando un papel importante en el ecosistema. Hongos pueden aislados, cuantificados y examinados en el laboratorio.
Hongos son abundantes en suelos superficiales y desempeñar funciones importantes en el ciclo de nutrientes y descomposición de materia orgánica y contaminantes. Siendo incapaces de sintetizar sus propios alimentos se clasifican como heterótrofos y son aeróbicas y por lo tanto requieren oxígeno.
A los hongos de cultivo, suelo muestras diluidas a concentraciones conocidas en agua estéril, luego revestidas en placas de agar y se incubó. Las colonias de hongos que pueden contabilizarse e identificadas.
Este video ilustra los principios detrás de la aislamiento, cuantificación e identificación de hongos filamentosos.
Suelos generalmente contienen millones de hongos por gramo; por lo tanto, diluciones seriadas se utilizan para preparar las muestras de suelo para análisis. Una cantidad dada de suelo se agrega a una solución dispersante. Alícuotas de la suspensión se transfieren a una solución de tampón en serie hasta que la suspensión se diluye suficientemente como para discretas colonias fúngicas crecer.
Estas diluciones son entonces plateadas en medios de agar y se incubaron. Una vez que se han formado colonias de hongos visibles, pueden ser contados. Como se asume que cada colonia de hongos se deriva de un solo organismo, el término unidades formadoras de colonias o UFC, se utiliza para expresar el número de organismos calculados por gramo de suelo seco.
Mayoría de los hongos crece como hifas, que son de largos, ramificando en estructuras que son el modo principal de crecimiento vegetativo. Agregados de hifas se denominan micelio. Hongos pueden existir como organismos unicelulares solo, con la levadura, siendo un ejemplo bien conocido.
Reproducción de hongos puede ocurrir de varias maneras. Hongos que producen hifas pueden reproducir asexualmente, por fragmentación de hifas, o de tallos con semillas como esporas. Hongos unicelulares pueden reproducir asexualmente por gemación.
Hongos también pueden reproducirse sexualmente. Esto es menos común que la reproducción asexual y ocurre generalmente en respuesta a condiciones ambientales desfavorables. En la producción de hifas de hongos, dos hifas reproductivas de diferentes cepas fúngicas pueden fundirse, creando un cigoto. En los hongos unicelulares solo, dos células de cepas opuestas fusible.
Los suelos fértiles contienen normalmente en el rango de 106 hongos "propágulos" por gramo de peso seco. Propágulos son esporas de hongos, hifas y fragmentos hyphal. Usando cuentas de placa cultivables es una técnica rápida, barata y reproducible para aclarar el contenido de hongos. Sin embargo, resultados pueden estar sesgados por el hecho de que no todos los organismos se cultivo en las placas de los medios de comunicación.
Placas de agar rosa de Bengala con antibióticos como la estreptomicina, se utilizan típicamente para culturas fungicidas. Porque las bacterias son mucho más numerosos que los hongos en la mayoría de los suelos, el medio ideal de hongos seleccionará contra el crecimiento bacteriano mientras permite que los hongos para sobrevivir. Colorante Rosa de Bengala inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias y reduce el tamaño de las colonias fúngicas. Este es ideal y evita el crecimiento excesivo de las placas de hongos así como controla las bacterias.
Ahora que estamos familiarizados con los principios del cultivo de hongos filamentosos, echemos un vistazo a cómo esto se lleva a cabo en el laboratorio.
Una vez que se han recogido las muestras de suelo, llevarlos al laboratorio para su análisis. En primer lugar, calcular el contenido de humedad del suelo. Añadir agua desionizada para traer el contenido de humedad a 15%.
Cubrir los recipientes con plástico para envolver y asegurar con una banda elástica para limitar la evaporación. Pinchar la película varias veces para permitir la aireación.
Pesar la muestra de suelo y envase y registro. Incubar a temperatura ambiente durante una semana para permitir el crecimiento de los hongos que ocurren naturalmente.
Volver a pesar las muestras de suelo y envase y registrar el peso. Calcular la pérdida de peso debido a la pérdida de humedad durante la semana. Añada agua al suelo, para llevar el peso hacia atrás al valor original.
Añadir 10 g de suelo húmedo a 95 mL de agua destilada y mezclar bien. Esta es la dilución 10-1 ya que 10 g de suelo tiene un volumen de aproximadamente 5 mL. Realizar cuatro diluciones seriadas de 1 mL en espacios en blanco de 9 mL agua de esta solución.
A continuación, recoger ocho placas de agar rosa Bengala de estreptomicina estériles. Dos de las placas, Añadir 0,1 mL de dilución tubo 10-2y repartidas en la superficie del agar utilizando un separador de cristal llama etanol esterilizada. Porque una cantidad de 0,1 mL es plateada, esto hace que la efectiva dilución 10-3.
Incubar las placas en un armario oscuro a temperatura ambiente, durante una semana.
Después de una semana, contar las colonias discretas en cada plato. Deben contarse las placas con colonias fúngicas de 10 a 20. Observar y describir características distintivas de las placas o las colonias.
Tomar un portaobjetos de vidrio limpio y depositar una gota de lactofenol fluido de montaje en el centro. Con unas pinzas para evitar la contaminación, corte una tira de cinta adhesiva transparente alrededor de 3 cm de largo. Si es necesario, utilice una aguja de disección para liberar la cinta de los fórceps.
Aplique el lado adhesivo de la cinta a la superficie de una colonia esporulación del hongo, teniendo cuidado de evitar la presión excesiva. Luego, aplique el lado adhesivo de la cinta con la muestra de esporas para el fluido de montaje en el portaobjetos de cristal. Frote suavemente la cinta con un instrumento liso, plano para eliminar burbujas de aire.
Examine el cinta de montaje bajo un objetivo de alta potencia.
Hongos pueden identificarse microscópicamente por la examinación de los cuerpos fructíferos y esporas. Una clave de identificación de hongos puede ayudar a este proceso. Tipos de hongos comunes observaron incluyen Penicillium y Aspergillus.
Usando las placas, los hongos se pueden enumerar usando la misma técnica que con la enumeración bacteriana.
Identificación y cultivo de hongos es útil para una variedad de aplicaciones.
Las industrias como pulpa y papel producción de servicios pueden usar hongos filamentosos a degradar la madera en su proceso que reduce a pulpa, en una técnica conocida como biopulping. Hongos como pudrición blanca pueden degradar astillas eficientemente, llevando a la disminución de la necesidad para el uso de químicos o mecánicos que reduce a pulpa.
Hongos pueden utilizarse también para otros materiales, como ciertos tipos de plásticos biodegradables se descomponen. Esto puede ser útil para aplicaciones agrícolas o jardinería, donde películas de acolchado biodegradable pueden utilizarse para crear barreras temporales para crecimiento de plantas no deseadas.
Los hongos también son productores de antibióticos, compuestos que revolucionaron la medicina en el siglo XX y siguen siendo una defensa de primera línea en la infección hoy en día. Penicilina, un antibiótico ampliamente utilizado, fue aislado de los hongos filamentosos comunes Penicillium rubens. Hoy en día, hongos filamentosos son todavía aislados y estudiados en la búsqueda de nuevos antibióticos.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a los hongos filamentosos. Ahora debería entender cómo cultivar hongos filamentosos del suelo, cómo cuantificarlas y cómo identificar los tipos de hongos que se encuentran comúnmente en el suelo. ¡Gracias por ver!
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Results
Recuentos de colonias
El número de colonias de hongos por gramo de suelo es igual al número de colonias contadas en la placa multiplicada por el recíproco de la dilución plateada. Por ejemplo, si se cuentan las 46 colonias a una dilución de 10-5, entonces la UFC por gramo de suelo es 46 x 105 o 4.6 x 106.
Identificación de tres géneros diferentes de hongos
Hongos pueden identificarse microscópicamente por la examinación de los cuerpos fructíferos y esporas. Una clave de identificación de hongos puede ayudar a este proceso. (Figura 4) Tipos de hongos comunes observaron incluyen Penicillium y Aspergillus.
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Applications and Summary
Dilución y galjanoplastia de hongos del suelo pueden utilizarse como un indicador de la salud de un suelo. Normalmente un suelo fértil "sano" tendrá 105 106 hongos por gramo de suelo. Puede utilizarse también para aislar cultivos puros de hongos específicos, posteriormente evaluados para propiedades específicas, tales como la capacidad de degradar compuestos orgánicos. Estos pueden ser perjudiciales como es el caso de los hongos de podredumbre blanca, o beneficiosos cuando tóxicos orgánicos son degradados a través de la biodegradación. Otros usos de cultivos puros de hongos incluyen el aislamiento de hongos antibióticos. Por ejemplo, el primer antibiótico fue alguna vez la penicilina, producida por el hongo Penicilliumdel suelo. Esto fue descubierto por Sir. Alexander Fleming en 1929.
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References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
