Overview
マーガレット職人とキンバリー ・ フライ - デュポール大学のソース: 研究所
遺伝子組み換え食品の健康・環境安全上議論の懸念のために物議を醸す問題となっています。この実験は技術的な理解を示して食品 DNA 遺伝子を識別する方法の食糧供給に遺伝子組み換えの安全性と潜在的な危険性について遺伝子組換え (Gmo) の決定教育を可能にします。
ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して、食品の食品に遺伝子組み換え DNA の存在をテストする DNA を増幅します。特定の DNA バンドの存在を検出するには、3% の agarose のゲル、遺伝子組み換え DNA を含んでいる DNA のバンドを分離する密度の高い濃度で抽出した食品 DNA をプルするゲルの電気泳動を使用します。いくつかのコントロール DNA は正常にテスト食品 (工場プライマー) から抽出遺伝子両方の知られている例を提供するために DNA (遺伝子組み換え DNA を購入) を変更して電気泳動手順で使用し、非遺伝子組み換え DNA (認定の非遺伝子組み換え食品管理を購入)。
Principles
ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、GM 工場に挿入された DNA の配列を識別します。蛋白質と対照をなして比較的安定した分子である DNA、DNA のフラグメントの加工度の高い商品から分離できるので、PCR によって増幅されるため十分にそのまま従って。遺伝子工学の挿入された遺伝子の発現を制御する制御配列 (プロモーターとターミネーターのシーケンス) の数が少ないを使用して、これらのシーケンス、遺伝子組み換え作物の大半に共通。この手順で指定された 2 つのシーケンスは、2 つの最も一般的な規制シーケンス、カリフラワー モザイク ウイルス (CaMV) から 35 s プロモーター遺伝子とアグロバクテリウムから nopaline 合成酵素 (NOS) ターミネーター遺伝子です。
PCR にはTaq DNA ポリメラーゼによるテンプレートの変性、プライマーアニー リング、および焼なまし材のプライマーの拡張子で構成される各繰り返しのサイクルが含まれます。食べ物から DNA が抽出される、サーマルサイクラー、PCR のサイクルの段階の原因と急速に温度を操作する使用されます。
変化のステージは、サンプルが急速に分離する dna を引き起こして、94 ° C に加熱すると発生します。59 ° C を急速冷却プライマー分離された dna にアニールし、プライマー、各 DNA 鎖の完全なコピーを作成し、1 つの熱サイクルを完了するを拡張するTaq DNA ポリメラーゼのための 72 ° C に再加熱することができます。
増幅された DNA は、35 s プロモーター遺伝子と NOS ターミネータの識別のため目に見えるバンドに DNA を分離する電気泳動のゲルを実行できます。増幅された DNA は、上下に周囲のバッファーに溶解を防ぐためにサンプルの重量を量ることができます購入した読み込み色素を用いたゲルの 1 つの端に井戸に読み込まれます。読み込み染料色素「戦線」の電気泳動間 DNA 動きを見ることができるのでも視覚的、提供しています電気泳動プロセスは、陰極と陽極の両端に分かれて電流を使用して動作します。DNA が読み込まれます、商工会議所の陰極側に最も近いエンドでゲル化し陽極室末に惹かれる DNA の負の電荷 agarose が引っ張らDNA (塩基数の増加) の大きい配列は agarose を介して簡単に移動できず、小さいシーケンスが陽極の終わりの方のゲルを遠くに旅行することが早期に分離されます。
背景ゲルと DNA の結果のより良い視覚化のための銀行との間のコントラストを追加するために、DNA に結合して染色のプロセスに役立ちます。使用して、各テストのゲルは 35S プロモーターと NOS ターミネータ遺伝子の存在の有無について分析できる DNA シーケンスの異なるサイズの既知の場所が用意されています。
コントロールは、DNA が正しく抽出されることを確認するテスト食品サンプルとの比較を提供するために使用されます。購入した植物のプライマーは、核酸のすべての植物に共通を提供するために各サンプルに追加されます。これにより DNA 抽出過程の品質管理チェック、抽出植物の DNA が PCR の間にこのプライマーで拡張する必要がありますが完了する電気泳動ゲルで見てはならないので。35 秒と NOS 遺伝子のため購入したプライマーは、遺伝子組み換えのゲルの DNA バンドを提供する肯定的な制御として使用されます。遺伝子組み換え肯定的なテンプレート コントロールが増幅しない場合 PCR 反応に問題があるし、検査食から GMO 負の結果は信頼できません。認定の非遺伝子組み換え食品も購入、DNA の分離がどのように見えるかの遺伝子組み換え材料が存在しないときに表示するネガティブ コントロールとして使用されます。
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Procedure
1. 食品サンプルからの DNA の抽出
- 200 1,000 μ L のボリューム調節可能なマイクロ ピペット、ピペットを使ったり 2 スクリュー キャップ チューブのそれぞれに購入した PCR ミックス行列の 500 μ L を追加します。PCR マトリックスを均等にミックスする各因数のピペットで、上下のピペットします。
- 1 つのスクリュー キャップ チューブ「非遺伝子組み換え」と「テスト」ラベルを付けます。
- 認定の非遺伝子組み換え食品の 0.5 g を量り、乳鉢に入れてください。
- 2.5 mL の蒸留水を加えて、スラリーを形成する 2 分乳棒で粉をひきます。
- もう一つの 2.5 mL の蒸留水を追加し、杵スラリーはピペットに十分に滑らかになるまで研削を続けます。
- ピペット 50 μ L を 500 μ L の PCR プレミックスを含むスクリュー キャップ チューブ地面スラリーのラベル「非遺伝子組み換え」卒業のピペットで 50 μ L のマークを使用。チューブを要約します。
- 1.3-1.6 食品試料を準備する手順を繰り返します。
- ピペット 50 μ L スクリュー キャップ チューブに地上テスト食品スラリーの「テスト」というラベルの付いた。チューブを要約します。
- 渦非遺伝子組み換え食品、検査食の PCR は 95 ° C の水浴 5 分で 1 分と場所管用チューブします。渦が利用できない場合は、チューブに水浴に配置する前に混合する数回をフリックします。
- 5 分間、遠心分離機でチューブを配置します。固体ペレットは、管の下部に形成する必要があります。場合は 5 分、ペレット フォームまで 2 分間隔、再び遠心分離後は、ペレットは形成されていません。
- チューブは、PCR のためすぐに使用または 1 週間冷蔵庫で保存できます。
2。 PCR の反作用の設定
- PCR チューブ 1-6 の番号し、それらの初期します。数字は、表 1に記載されている以下のチューブ内容に対応する必要があります。
- オープン キャップ付きマイクロ チューブ ホルダーでラベル付けされた各 PCR チューブを配置します。
- 新鮮なヒントを使用すると、追加するたびに、各 PCR チューブに表 1に示されているプライマーの 20 μ L を追加します。チューブをキャップします。
- 新鮮なヒントを使用すると、各チューブのため、各 PCR の管、ピペットの上澄みからのみしている、管の下部に固体ペレットを回避するのに、表 1に示されている DNA のサンプルの 20 μ L を追加します。
- 各 DNA のサンプルは、対応する PCR チューブに戻は後、は、上下に軽くピペッティングによる DNA とプライマーを混合するピペットを使用してください。チューブを要約します。
- サーマルサイクラー内 PCR チューブに置きのサーマルサイクラーをプログラムします。
1 : 初期変性94 ° c 2 分サイクルします。
94 ° c 1 分増幅: 40 サイクル (変性)、59 ° C (焼鈍) 1 分と 2 分 (拡張子) のための 72 ° C。
最終的な拡張: 72 ° C、10 分で 1周します。
保持: 4 ° C 無期限に。
3. 3% の Agarose のゲルの準備
- ラボやマスキング テープ、ゲル トレイの開いた端部をしっかりとテープを使用します。テープは溶融 agarose の漏れを防ぐためにトレイの端にシールを確認します。
- 3 g 以上の 250 mL の三角フラスコに agarose の重量を量り。
- 100 mL の 1 の x TAE のバッファー (購入または濃縮物から調製した) を追加します。
- 磁気のホット プレートを使用すると、攪拌棒、ビーカー アガロースをバッファー、およびソリューションに完全に溶解するまで熱が沸騰とが明確になります。また、オーブンにビーカーを置き、すべて 10 s、混合物を沸騰するまで繰り返しと明確なターンを混ぜて攪拌棒を使用して 30 秒間隔のための加熱は電子レンジを使用できます。
- アガロース溶液の蒸発を防ぐ、還流として 250 mL フラスコの開口部に 50 mL 三角フラスコを反転します。
- 60 ° C に冷却するアガロース溶液を許可し、各録音されたゲル トレイに 30-50 mL を注ぐ。
- ゲルの井戸を作成するノッチの最初のペアにゲル櫛を配置します。
- テープと櫛を削除する前に完全に冷却するゲルを許可します。ゲルが固めるし、クリアから曇りのときに準備ができて、約 10-20 分。
4 PCR 産物の電気泳動
- ゲル トレイの上にあらかじめ用意された 3% の agarose のゲルを置くか注がれた 3% の agarose のゲルをキャストに使用されているゲル トレイを使用します。
- 陰極 (ブラック) 末尾に近い井戸を用いた電気泳動室にゲル トレイをスライドさせます。
- 商工会議所、十分なゲル トレイの上部バッファーの 2 ミリメートルを持っていることに 1 x TAE バッファーを注ぐ。
- PCR チューブをサーマルサイクラーとマイクロ チューブ ホルダーの場所から取得します。
- 毎回新鮮なピペット チップを使用して、購入したオレンジ g ローディングの染料 (LD) 各サンプルに 10 μ L を加え、よく混ぜます。
- 分子量ルーラーの負荷 20 μ l と順序でゲルに各サンプルの 20 μ L (表 2) を示します。
- 100 V で 30 分のゲルの電気泳動を実行します。
- トレイから削除する商工会議所とスライドのゲルからゲル トレイを取り外します。染色トレイにジェルを塗布します。
- ご購入の DNA ゲル染色ゲル全体に染色を配布するためのトレイを慎重に揺れ、5 分間でゲルを浸します。
- 洗浄容器にゲルを転送し、リンス水道水 (40-55 ° C) 約 10 秒。
- 最良の結果のための穏やかな揺れで 6 分間温かい水道水で 3 倍を洗浄することによりすすぐ。必要に応じて、目的のコントラストに到達するまで、暖かい水で染め色を続行します。
| 管番号 | プライマー | Dna のサンプル |
| 1 | 20 μ L 工場プライマー (グリーン) | 20 μ L 非 GMO 食品コントロール DNA |
| 2 | 20 μ L GMO プライマー (赤) | 20 μ L 非 GMO 食品コントロール DNA |
| 3 | 20 μ L 工場プライマー (グリーン) | 20 μ L テスト食品 DNA |
| 4 | 20 μ L GMO プライマー (赤) | 20 μ L テスト食品 DNA |
| 5 | 20 μ L 工場プライマー (グリーン) | 20 μ L GMO ポジティブ コントロール DNA |
| 6 | 20 μ L GMO プライマー (赤) | 20 μ L GMO ポジティブ コントロール DNA |
表 1。適切な管数やプライマー、DNA のサンプルの一覧です。
| まあ 1 | サンプル工場プライマー 20 μ L と 1 の非 GMO 食品コントロール。 |
| まあ 2 | GMO プライマー 20 μ L で 2 の非 GMO 食品管理をサンプルします。 |
| まあ 3 | 3 テスト食品工場プライマー 20 μ L のサンプルします。 |
| まあ 4 | GMO プライマー 20 μ L で 4 の試験食品をサンプルします。 |
| まあ 5 | 5 工場プライマー 20 μ L で遺伝子組み換え肯定的な DNA をサンプルします。 |
| まあ 6 | GMO プライマー 20 μ L で 6 の遺伝子組み換え肯定的な DNA をサンプルします。 |
| まあ 7 | PCR 分子量定規 20 μ L。 |
| まあ 8 | 空のままにします。 |
表 2。20 μ L の分子量定規と各サンプルの 20 μ L をゲルに読み込むに適切な順序。
遺伝子組み換え食品は、成分や成分で dna 鑑定が具体的に変更を含む製品です。ポリメラーゼの連鎖反応と呼ばれる手法を使用して、これらの変更の有無を検出できます。
遺伝子組み換え食品の健康・環境安全上議論の懸念のために物議を醸す問題となっています。関心の食品サンプルで変更された DNA は、遺伝子組み換えの安全性と潜在的な危険性について教育を受けて意思決定遺伝子を検出する機能変更または生物、遺伝子組み換え作物、食品の供給します。
ポリメラーゼの連鎖反応、または PCR、使用食品遺伝子組み換えシーケンスの存在の有無を決定する DNA を増幅します。ゲルの電気泳動は agarose のゲルのマトリックスを通して増幅された DNA を引っ張るし、変更または非変更されたマーカーに対応するさまざまなサイズの DNA バンドを分離します。これらは、遺伝子組み換え作物を含んでいる食品からコントロールのバンドと比較してまたは変更自由に知られています。
サンプル、DNA を抽出し、遺伝子組み換えのプロセスで使用されるマーカーを増幅する方法、遺伝子組み換え作物の存在有無を食品サンプルでの確立、このビデオは食品から遺伝子組み換え DNA を検出原理を説明します。
ポリメラーゼの連鎖反応は、遺伝子組み換え食品に挿入された DNA の配列を識別します。DNA は比較的安定した分子は、実行可能な DNA 断片の増幅に適しては分離することができますからも高い加工品、チップ、トウモロコシや野菜のハンバーガーのような。
規制の DNA シーケンスの数が少ない、遺伝子組み換え作物の大半にこれらのシーケンスがあるので挿入された遺伝子の発現を制御する使用されます。この手順は、2 つの最も一般的に使用される、35 s プロモーター遺伝子、nopaline 合成酵素ターミネーター遺伝子を識別します。35 秒のシーケンスは強力なプロモーター、挿入遺伝子に接続すると、ドライブ式の定数、高レベル。Nopaline 合成酵素のターミネーターが目的のエンドポイントで挿入された遺伝子の転写を停止に含まれます。
PCR は、サーマルサイクラー、PCR 反応管の温度をしっかりと制御機のサイクルを冷暖房システムに繰り返し必要があります。94 ° C にサンプルを加熱変性し別の dna が発生します。急速に冷却 45 ~ 65 °Cにより分離された dna にアニールするプライマー。最後に、72 °Cに加熱により、プライマーとターゲット領域の完全な複製を拡張するTaqポリメラーゼ酵素。
購入した工場プライマーは、各サンプルに追加され、植物 DNA を含む試料で増幅されます。35 s と NOS の遺伝子組み換え肯定的なテンプレートは遺伝子組み換え作物の肯定的な制御を提供するために使用します。認定非 GMO は、ネガティブ コントロールとして使用されます。予期しないバンドを表示これらのコントロール反応のいずれかの試験の結果は信頼できません。
増幅された DNA は、電気泳動ゲルを介して実行されます。PCR の製品は染料と混合、井戸に読み込まれます。DNA は負荷電し、商工会議所の陰極端にゲルに読み込まれるとき通電すると陽極末尾方向に移動されます。大きい DNA のフラグメントは、簡単にゲルを通って行列がいて陰極に近い小さいシーケンスが明瞭なバンドに異なるサイズの DNA の分離の結果、陽極末尾方向に移動しながら、移動できません。
電気泳動後ゲル染色視覚化することで分離された DNA バンド。
今では私たちは GMO 検出と遺伝子組み換え同定 PCR、電気泳動の使用の背後にある原則に精通している、このことができますの実行方法研究室で見てをみましょう。
関心の食品を特定したら、分析を開始できます。DNA を抽出するには、2 つのきれいなタンパーエビデント チューブを取り出して上下均等に試薬を混合する因数に調和をピペットを確かめて購入した DNA 分離試薬のこれら転送 500 μ L のそれぞれに。管「非遺伝子組み換え」、および"テスト"のいずれかラベルを付けます。
次に、認定の非遺伝子組み換え食品の 0.5 g を量り、きれいなモルタルに。2.5 mL の蒸留水を加えて、スラリーを形成する 2 分乳棒で粉をひきます。別 2.5 mL の蒸留水の水を加えて、スラリーをピペットに十分な滑らかになるまで研削を続行します。
「非遺伝子組み換え「DNA 分離試薬タンパーエビデント チューブをラベル付けする既知の非遺伝子組み換えスラリーの 50 μ l をピペット。「テスト」マークされてタンパーエビデント チューブにテスト食品サンプル スラリーの 50 μ L を追加します。渦 2 つは食品サンプルと 1 分の DNA 試薬を含むチューブします。次に、95 ° C、5 分で水浴にチューブを配置します。最後に、5 分間遠心にチューブを置きます。検査でチューブの下部に固体ペレットを形成する必要があります。場合は 5 分、再びペレット フォームまで 2 分間隔、遠心分離後は、ペレットは形成されていません。サンプルは今、PCR のためすぐに使用または 1 週間冷蔵庫で保存できます。
まず、6 番 PCR チューブ。これらの数字は、表に示す管内容に対応します。オープン キャップ付きマイクロ チューブ ホルダーにラベル付けされた PCR チューブのそれぞれを配置します。
新鮮なヒントを使用すると、追加するたびに、各 PCR チューブに表に示す 20 μ L プライマーを追加します。次に、各 PCR チューブに表に示す DNA サンプルの 20 μ L を追加します。上下のピペットをミックスします。小球形にされたサンプルは、必ず、上清からのみピペットし、チューブの下部に固体ペレットを避けるため。最後に、サーマルサイクラー PCR チューブに配置し、冷暖房の表に示す手順を順番にそれをプログラムします。
陰極端に最も近い、井戸を用いた電気泳動室に 3% の agarose のゲルを配置します。ゲル トレイの上部 2 mm をカバーする商工会議所に TAE バッファーを追加します。たちから PCR チューブを収集し、マイクロ チューブ ホルダーに配置。毎回新鮮なピペット チップを使用して、購入した DNA 各サンプルにローディングの染料の 10 μ L を加え、よく混ぜます。
この表に示されているように、1 つの井戸とその後井戸に各サンプルの 20 μ L に分子量定規の 20 μ L の agarose のゲルの井戸を読み込むたびに新鮮なヒントを使用して。100 V で 30 分間実行する電気泳動室を設定します。
ゲルが終了する実行している、慎重にゲル チャンバーを外し、トレイを取り外し、ゲルを染色トレイにスライドさせます。優しく汚れを配布するトレイを振って 5 分ゲル染色 x ご購入 100 でゲルを浸します。染色、洗浄容器にゲルを転送し、リンス水道水約 10, Destain の 3 分間温かい水道水で 3 回洗浄でそれぞれ最良の結果のための穏やかな揺れでそれぞれ。必要に応じて、目的のコントラストに到達するまで、暖かい水で染め色を続行します。
第 4 レーンで 200 bp のバンドの存在の有無は、試験食品に遺伝子組み換え作物が含まれているかどうかを示します。工場プライマーは、植物の DNA サンプルからの抽出できたかどうかを決定します。非遺伝子組み換え食品管理指標である偽肯定的な結果が発生します。非遺伝子組み換え食品管理が出てくる場合、正の値として、PCR がある時点で汚染されていたといいます。遺伝子組み換え肯定的なテンプレート コントロールは、有病誤診のインジケーターです。遺伝子組み換え肯定的なテンプレート コントロールが増幅しない場合 PCR 反応に問題があるし、検査食から GMO 負の結果は信頼できません。
DNA バンドを強調する対照的な背景を提供する白または黄色の紙に配置できるゲルまたは増加コントラストは UV ライト ボックスを使用して達成することができます。
食品や遺伝子組み換え成分の製品をテストすることは科学的なまたは規制上のアプリケーションの数に関連します。
組換え DNA 遺伝子組み換え作物から野生の穀物の人口のゲノムの交雑になることをいくつかの証拠があります。たとえば、花粉は、野生型遺伝子組み換えソースから花粉植物を肥やすことによってこの転送を促進するかもしれない。これは、問題全体として生態系にこれらの挿入された遺伝子の拡散の影響をよく理解されていません。野生の個体群の PCR テストは広がり、潜在的または遺伝的挿入の成功の封じ込めにデータを提供できます。
ラベル付け、または、遺伝子組み換え成分の不適切なラベルの欠如は、消費者の懸念をすることができます。これは、消費の消費者の嗜好や GM の過程でアレルゲンの潜在的な導入のため、後者は物議を醸すかもしれません。いくつかの国では、遺伝子組み換え成分食品包装に表示する必要があります。このような国の規制当局は、PCR の食品表示の正確性をチェックするテストを使用できます。
遺伝子組み換え作物に導入が農薬抵抗性を与えるいくつかの研究は「スーパー雑草」の生産についての懸念を調達しています。基本的に、最初異種交配などのメカニズムを介して殺虫剤への抵抗を取得変更対象植物のいずれかを指定できます。これらの植物が広がって、もっと首尾よくすることができるし、コントロールに挿入することがなくよりも難しくなります。PCR は遺伝子組み換えのテストを強調表示し、この普及が問題になるかどうかは、このような潜在的な集団を追跡する助けることができます。
ゼウスの遺伝子組み換え食品入門テストを見てきただけ。今、PCR、抽出し、食品からの DNA を増幅する方法と食品サンプルが遺伝的に変更されているかを確認する方法を使用して遺伝子組み換え食品を識別する背後にある原理を理解してください。見てくれてありがとう!
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Results
染め色、35 s プロモーターと NOS ターミネータ遺伝子の DNA バンドがゲルの既知の場所に存在するかを決定するテスト食品レーン (表 3) を見てゲルを分析できます。UV ライト ボックスにゲルを置くこと増加コントラスト (図 1) を提供することができます。また、ゲルは、DNA バンド (図 2) を強調する対照的な背景を提供する白または黄色の紙に配置できます。
図 1。DNA のバンドを分離を示す destained ゲル。UV ライト ボックスに agarose のゲルの電気泳動、次ゲル。
図 2。35S プロモーターと NOS ターミネータ DNA の既知の場所の図。5 レーンで 200 bp のバンドの存在の有無は、試験食品に遺伝子組み換え作物が含まれているかどうかを示します。
| レーン 1:工場プライマーと非遺伝子組み換え食品 | 455 bp |
| レーン 2:GMO のプライマーと非遺伝子組み換え食品 | 帯なし |
| レーン 3:食品工場プライマーをテストします。 | 455 bp |
| レーン 4:GMO のプライマーと検査食 | 200 bp または帯なし |
| レーン 5:工場プライマーと遺伝子組み換え肯定的なテンプレート | 455 bp |
| レーン 6:GMO のプライマーと遺伝子組み換え肯定的なテンプレート | 200 bp |
| レーン 7:PCR 分子量定規 | 1,000、700、500、200、100 bp |
表 3。PCR サンプル バンド サイズ (塩基対 (bp))。
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Applications and Summary
ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して、広い範囲の DNA ラボ テストを可能にする DNA を増幅します。農作物の遺伝子組み換えで今可能な PCR の存在をテストすることによって遺伝子組み換え作物を識別することですまたは不在 DNA のシーケンスをテストの 1 つの領域が使用されます。通常、作物は、理想的な収穫、害虫 (図 3)例えば病気、干ばつ条件 (図 4) などに自然の抑止力に対する優位性を付与する遺伝子組み換えです。利点は、作物植物の DNA に別の種からの遺伝物質を挿入することによって得られる、ので、潜在的な人間の健康や環境リスクを遺伝子組み換え作物の使用を識別されています。つの環境問題は、遺伝子組み換え DNA 作物のゲノムの非遺伝子組み換え作物として販売するものを入力する可能性があります、受粉過程を通じて意図せず交換される遺伝子組み換え DNA の機能です。
図 3。ジャガイモの葉を食べて、コロラド州カブトムシの幼虫。
図 4。トウモロコシは干ばつによって破壊されました。
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