Summary
Ce rapport fournit une représentation visuelle des plaques parallèles d'analyse chambre d'écoulement pour l'étude des interactions des leucocytes endothéliales sous la contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle de l'endothélium (E)-sélectine et la E-sélectine leucocytaire ligands qui déclenchent des leucocytes roulant sur la surface des cellules endothéliales.
Abstract
E-sélectine est une protéine de type-1 membrane sur les cellules endothéliales microvasculaires qui aide procéder au recrutement des leucocytes circulants vers les tissus cutanés, des os et enflammées. E-sélectine expression est constitutive le microvaisseaux cutanée et osseuse et est inductible par les cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-1α / et le TNF-α, sur microvaisseaux dans les tissus enflammés. Ce récepteur lectine médie les interactions faibles en glucides contraignant avec des contre-récepteurs ligands sur leucocytes circulants, ce qui entraîne un comportement caractéristique de roulement. Parce que ces interactions adhésives des événements précèdent plus stable et l'activité diapédèse, la caractérisation de l'activité de laminage des leucocytes et l'identification des leucocytes E-sélectine ligands ont été les principaux objectifs dans les études de trafic des leucocytes et l'inflammation et dans le développement de thérapies anti-inflammatoires (1-5) . Le but de ce rapport est de fournir un visuel, la description complète de la technologie la plus largement utilisée pour étudier la E-sélectine interactions ligand E-sélectine dans des conditions physiologiques des conditions d'écoulement du sang. Notre laboratoire en collaboration avec le Centre de recherche sur les maladies cutanées Harvard utilise un état de l'art à plaques parallèles appareil de chambre de circulation accompagnée de visualisation numérique et un logiciel d'enregistrement de nouvelles, NIS-Elements. Cette technologie nous permet d'analyser les événements d'adhérence en temps réel pour la visualisation à l'écran ainsi que l'activité d'enregistrement de roulement dans un format vidéo. Paramètres d'adhérence cellulaire, tels que le laminage de fréquence, résistance au cisaillement et contraignant / tethering efficacité, sont calculées avec le logiciel NIS-Elements, exportés vers un tableur Excel et soumis à une analyse statistique. Dans la démonstration présentée ici, nous avons utilisé la chambre de circulation à plaques parallèles pour enquêter sur la E-sélectine-dépendante l'activité des leucocytes roulant sur direct des cellules endothéliales de moelle osseuse (HBMEC). Homme cellules hématopoïétiques progénitrices KG1a, qui expriment un haut niveau de la E-sélectine ligand, ont été utilisés comme notre modèle leucocytes, tandis que d'une ligne HBMEC immortalisée de cellules, cellules HBMEC-60, a été utilisé comme modèle de cellules endothéliales (6). Pour inciter et de simuler natif E-sélectine expression dans la chambre d'écoulement, HBMEC-60 cellules ont d'abord été activés par l'IL-1. Notre vidéo de présentation a montré que l'analyse des flux à plaques parallèles est une méthode appropriée pour l'étude de la E-sélectine-médiée physiologique des leucocytes activités de laminage et que la caractérisation fonctionnelle des leucocytes E-sélectine ligand (s) dans la chambre d'écoulement peut être constatée par la mise en œuvre de la protéase ou de glycosidases digestions.
Protocol
1. Préparation de HBMEC (HBMEC-60 Cell) monocouche sur boîtes de Pétri pour la Chambre de débit
- Manteau 35 x 10mm de culture de tissus plats avec 2ml de la fibronectine 20μg/ml (dans du PBS) pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 3 heures à 37 ° C.
- Aspirer solution de fibronectine de plats et ajoutez 1,5 x10 5 cellules HBMEC-60 [Moyenne 199 avec HEPES & glutamine, 10% de FBS, 10% de sérum humain, 5 unités / ml d'héparine, 1ng/ml facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes, 1% de pénicilline- La streptomycine] pour le plat et leur permettre de croître jusqu'à la confluence> 90%. (Cela prend 2 jours)
- Aspirer les milieux de croissance et, pour mettre à réguler l'expression de sélectine E, ajouter milieu frais avec de l'IL-1β 50ng/mL pour 4-6 heures. Monocouches de cellules sont maintenant prêts à rouler dosage. Pour bloquer la fonction E-sélectine, neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (clone BBiG-E4 (5D11)) peuvent être ajoutés à 20μg/ml pour ~ 1h à 37 ° C.
2. Préparation des cellules hématopoïétiques humaines KG1a progénitrices des Chambre de circulation
- Homme cellules hématopoïétiques progénitrices KG1a sont cultivés jusqu'à la confluence (1x10 6 cellules / ml) dans du RPMI-1640 avec la glutamine et 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine et sont pipetés directement à partir du flacon pour une utilisation dans le dosage chambre d'écoulement.
- Le nombre de cellules est calculé en utilisant un hématimètre puis les cellules sont remises en suspension à 1 x 10 6 cellules / ml dans du HBSS avec 10mm HEPES (H / H Tampon) et 2mm CaCl 2
- Les cellules sont stockées sur la glace jusqu'à utilisation dans le dosage.
3. Préparation du microscope, Chambre de circulation à plaques parallèles et pompe seringue (Figure 1)
Figure 1. Illustration de plaques parallèles Analyse Chambre de circulation. Microscope inversé, Harvard seringue pompe, ordinateur / caméra et chambre d'écoulement à plaques parallèles sont placés dans un arrangement optimal pour l'analyse cellulaire efficace et reproductible.
- Tournez sur la puissance et la source de lumière pour microscope inversé et le pouvoir de la pompe seringue et sélectionnez l'objectif 10x sur le microscope.
- Placer 50 ml tube conique dans le support et la remplir de H / H et 2mm CaCl 2.
- Placer les tubes à essai en plastique de 5 ml dans le porte-tube à essai en dessous du tube de 50 ml coniques
- Placer 60 ml seringue dans la seringue électrique (Soyez sûr que les deux sur le piston et le corps de seringue sont à la fois sécurisé).
- Fixez 3-way robinet d'extrémité de la seringue de 60 ml et joindre une seringue de 5 ml à 3 voies robinet.
- Placer un appareil parallèle Chambre de circulation (GlycoTech, Inc) sur scène microscope avec tube d'entrée vers la droite, le tube de sortie à gauche et à tubes sous vide à l'arrière.
- Fixez tube à vide au vide et valve d'air ouverte pour permettre à un appareil à plaques parallèles d'adhérer à la scène. (Ce teste si la jupe de vide sur la chambre d'écoulement est étanche à l'air.) Tournez le robinet d'air.
- Attacher la ligne de sortie tube (à gauche du microscope) à 3 voies robinet. Appareil est maintenant prêt pour la mise sur plaque monocouche HBMEC-60.
- Plaque monocouche Placez HBMEC-60 et le placer sur le centre du microscope.
- Allumez le vide et la position de l'appareil de chambre de circulation au-dessus du plateau de telle sorte que la plaque monocouche est au centre.
- Abaissez doucement l'appareil chambre d'écoulement sur la plaque monocouche HBMEC-60 et un appareil permettant de chambre d'écoulement d'aspiration vers le bas. (Il ne faut pas les sons de l'air qui s'échappe et à ce stade, vous pourriez avoir besoin pour appliquer une pression à la chambre pour comprimer le joint en caoutchouc.)
- Une fois vide a été créé, le tube d'entrée place (à droite) dans le tube conique contenant 50 ml H / H avec 2 mM CaCl 2.
- Ouvrez 3-way robinet pour permettre l'écoulement dans la seringue de 60 ml et d'une pompe dans "mode pompe."
- Pour éliminer l'air d'entrée / sortie sans soulever les cellules sur la plaque, utiliser la pompe seringue fixé à 2mL/minute pour remplir le tube d'admission, puis rapidement réglé à 0,5 ml / minute, juste avant le fluide atteint l'appareil. Il est impératif d'amorcer cette mise en place avec soin et éviter les bulles d'air qui va soulever la monocouche de la plaque.
- Une fois que le fluide est vu passer dans la seringue de 60 ml, la chambre de circulation et pompe seringue ont été amorcées et la chambre de flux est prêt à l'emploi. Cette mise en place sera répétée pour chaque exécution d'entrée de cellule et pour chaque nouvelle plaque nécessaire.
4. Capturer des leucocytes roulant événements en utilisant les éléments de NIS
- Ouvrez Elements NIS sur le bureau.
- Appuyez sur "play" icône de l'image en direct. L'exposition automatique vous permettra de voir la plaque plus facile pour l'instant et il est important de se concentrer.
- Soyez sûr que microscope est correctement mis sur la monocouche cellulaire.
- Une fois concentré, re-mis en exposition à la lumière une image / seconde et d'ajuster sur le microscope. L'image doit apparaître sur l'ordinateur et ne sera plus visible dans le viseur de microscope en raison de la faible clarté. Histogramme lumière peut alors être adjusted pour enlever l'exposition de fond ou d'améliorer la clarté des cellules.
- Cliquez sur bin 2X2 ou Bin Live pour obtenir une image qui est idéal pour la capture de film
- Cliquez sur "Macro" sur la barre de menu et sélectionner "écrire sur le port", sélectionnez le port "com3", et "ouverte". (Ceci ouvre le port afin de coordonner avec le pousse-seringue.
- Pipeter 1 ml de suspension cellulaire KG1a dans l'éprouvette 5ml près de la ligne tube d'entrée et ensuite placer la ligne d'entrée tuyau au fond de l'éprouvette.
- Aller à la barre de menu, cliquez sur "Capture", "time-lapse d'acquisition."
- Un nouveau menu apparaîtra. Sélectionnez le protocole durables 210 secondes, c'est la longueur du programme pour rouler sur HBMEC-60 cellules. (Chaque phase est programmée pour prendre une photo à chaque seconde pour la durée du protocole de la pompe. Il est également mis en place pour envoyer une commande par le port COM3 pour démarrer la pompe.) Si time-lapse est interrompue, la pompe ne s'arrêtera pas sur ses propres et doit être réinitialisé. Appuyez sur Annuler pour retourner vivre l'image.
- Régler la pompe seringue de "mode Programme", selon le manuel d'instructions. (Mode Programme permet de programmation manuelle des débits spécifiques (à savoir des niveaux de stress de cisaillement) pour être transmises dans la chambre et de dicter les interactions cellulaires au cours de la monocouche KG1a HBMEC-60 cellules). Réglages pour la cellule KG1a roulant sur les cellules HBMEC ont été les suivants 4,2 dynes / cm 2 pendant 45 s, 0,3 dynes / cm 2 pendant 60 s, et une augmentation progressive toutes les 15 s à un maximum de 4,2 dynes / cm 2
- Mur contraintes de cisaillement (W st) dans la chambre a été calculé selon l'équation suivante: W = st 6μQ / a, b 2, où μ est la viscosité estimé des médias (0,0076 P), Q est le débit volumique en ml / s, un canal est la hauteur (épaisseur du joint) en cm (0,03 cm), et b est la largeur du canal en cm (0,5 cm). Les débits ont été réglementées en utilisant le mode programme de la pompe à seringue.
- Microscope et l'ordinateur sont maintenant prêts à capturer une séquence en accéléré. Appuyez sur "Start Run" sur l'ordinateur pour commencer à acquérir des données. Lors de l'exécution du programme, n'oubliez pas d'ajouter des médias à l'éprouvette contenant des cellules KG1a afin de maintenir le tuyau d'entrée / sortie complète de support (Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air).
5. Dépendance de sialylation Terminal et glycoprotéine de surface pour la E-sélectine-médiation cellulaire KG1a 5. Roulant (figure 2; Clips Vidéos du 05/01 au 05/05)
- Dosage de la cellule KG1a roulant sur non-stimulés HBMEC-60 cellules. (Contrôle négatif), les cellules ont été préparées et KG1a infusé dans la chambre d'écoulement plus vivant non-IL-1β stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus.
- Dosage de la cellule KG1a roulant sur HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l'IL-1β. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus.
- Dosage de la cellule KG1a roulant sur HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l'IL-1β, puis en neutralisant anti-humain E-sélectine Moab. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre d'écoulement plus vivent IL- 1β stimulée HBMEC-60 prétraitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine AcMo comme décrit plus haut.
- Dosage de la sialidase digérée cellules KG1a roulant sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase pendant 1 heure à 37 ° C ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus.
- Dosage de la protéase cellulaire digérée KG1a roulant sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a protéase, bromélaïne 0.2U/ml pendant 1 heure à 37 ° C, ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus.
6. Analyse de la NIS-Elements-Capturé Cellules KG1a et représentation graphique des données cellulaire KG1a roulant
- Après la séquence de temps est acquise, sauvegarder les données.
- Allez à «mesurer» l'onglet sur la barre de menu et sélectionner "définir le seuil." Déplacer les barres afin que les cellules désirées sont colorés en rouge. Sélectionnez "toutes les images" puis "Ok". L'ensemble du time-lapse séquence doit maintenant être modifié avec des globules rouges visibles roulant.
- Aller à la "mesure" et sélectionnez "restrictions". (Restrictions permettent à l'utilisateur d'exclure des objets seuillée qui ne représentent pas les cellules roulant. Ceci est principalement contexte créé par la monocouche HBMEC-60.) Sélectionnez «zone» et min d'entrée et les valeurs max de la zone de cellules roulant. Répétez cette étape pour "allongement" et "la circularité."
- Sélectionnez "mesure" et sélectionnez "créer binaire utilisant des restrictions", et définir les valeurs de restriction pour optimiser le logiciel de reconnaissance NIS-Elements de cellules roulant sur monocouche de cellules HBMEC-60.
- Retour à «mesurer», sélectionnez «données sur le terrain", puis sélectionnez «données reset". Fermer ce menu.
- Retour à la "mesure" et soisélectionnez «champ de lecture".
- Ouvrez "mesure"; "Les données de terrain», sélectionnez «numéro ou les objets" puis sélectionnez "tous les domaines» et exporter des données vers Microsoft Excel.
- Sélectionnez "Effacer les données» pour préparer l'acquisition de cellules NIS-Elements de collecte de données suivant.
Résultats:
Figure 3. Plaques parallèles Analyse Chambre de circulation de E-sélectine activité de liaison sur les cellules KG1a. Cellules traitées avec KG1a sialidase ou de la protéase ont été analysés pour l'efficacité de roulement sur des monocouches de cellules HBMEC-60 pré-traitées avec de l'IL-1β. Contrôle négatif rouler expériences ont également été menées par l'analyse de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC -60 cellules ou sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules traitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (5D11). Fréquences de laminage de cellules ont été réalisés en triple et analysées avec le logiciel NIS-Elements. (Signification statistique *, p <0,001)
Dans ce rapport, basé sur la vidéo, nous avons fourni une représentation visuelle de la façon d'analyser des leucocytes - les interactions des cellules endothéliales dans des conditions physiologiques des conditions de stress de cisaillement. En particulier, nous avons analysé le rôle de la E-sélectine - E-sélectine ligands dans la médiation de tethering leucocytes et de roulement, un comportement adhésif nécessaire à l'engagement de l'enseignement secondaire plus stable des activités contraignantes par le biais des récepteurs tels que les intégrines et des récepteurs de l'acide hyaluronique. Utilisation de la chambre d'écoulement à plaques parallèles adaptées pour une utilisation avec un microscope inversé, Harvard seringue pompe, caméra vidéo et du matériel d'acquisition d'ordinateur / portable, nous avons mené des expériences dans laquelle E-sélectine ligand + cellules KG1a ont été utilisés comme notre modèle de leucocytes et de cellules HBMEC (HBMEC- 60) stimulées par des cytokines pro-inflammatoires, l'IL-1β, ont été utilisés comme notre E-sélectine + modèle de cellules humaines endothéliales (1-6). Comme indiqué précédemment, nous avons observé des cellules robustes KG1a roulant sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules sur une gamme de niveaux de contrainte de cisaillement dans une manière E-sélectine-dépendant (Figure 3) (différence statistiquement significative par rapport aux cellules KG1a roulant sur non-IL-1β HBMEC-60 cellules stimulées). Des contrôles négatifs, qui se composait de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules ou sur l'IL-1β stimulée HBEMC-60 cellules prétraitées avec anti-humain E-sélectine mAb, ont été réalisées en parallèle afin de démontrer la dépendance de stimulation des cytokines et E-sélectine expression pour l'activité de laminage (figure 3). Par ailleurs, l'analyse de laminage de cellules prétraitées avec KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou avec la bromélaïne, une protéase non spécifique connu pour digérer la E-sélectine surface de la glycoprotéine ligand, a souligné l'importance des résidus terminaux d'acide sialique et de la glycoprotéine de surface pour la E-sélectine ligand l'activité (2,3).
Discussion
Plaques parallèles d'analyse chambre d'écoulement est une société spécialisée dans le système de dosage in vitro utilisé pour l'étude des leucocytes - interactions adhésives endothéliales dans des conditions de cisaillement semblables à celles transmises à la surface d'une veinule post-capillaire. Comme le montre ici, dans notre présentation visuelle, nous démontrons la valeur de ce système d'enquête sur le rôle de la E-sélectine - E-sélectine ligands dans la médiation de tethering leucocytes et roulant sur la surface de l'endothélium microvasculaire activé. Nous aussi révéler l'application de la protéase, glycosidases et les traitements anticorps bloquant pour élucider le rôle de la E-sélectine et ses ligands dans ce système. Ces analyses sont hautement reproductibles et de contribuer à former une base expérimentale pour l'étude de la E-sélectine - Fonction ligand E-sélectine in vivo.
En plus d'étudier l'adhésion cellulaire avec des monocouches de cytokines activés cellules endothéliales microvasculaires (veine ombilicale HBMEC ou humain ou cellules endothéliales microvasculaires dermiques), des dosages peuvent être effectués en utilisant purifiée recombinante humaine ou de la E-sélectine E-sélectine-Ig molécules chimériques comme substrat de l'adhésion cellulaire. Autres interactions adhésives médiée par des leucocytes (L-)-sélectine et des plaquettes (P)-sélectine peuvent aussi être analysés en utilisant la technologie à plaques parallèles chambre d'écoulement. En faisant varier le type de cellule monocouche / protéine substrat ou des leucocytes entrée / modèles cellulaires sélectine-transfectant, les enquêteurs peuvent étudier le rôle de ces interactions dans des conditions physiologiques des conditions de stress de cisaillement.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt ou les divulgations.
Acknowledgments
Le financement de ce projet a été fournie par un Award Cancer Society American Scholar Recherche, (06-024-01-CSM à Charles J. Dimitroff), un National Institutes of Health / National Cancer Institute subventions (RO1CA118124 à Charles J. Dimitroff) et une National Institutes of Health / National Institute of Arthritis and Maladies musculo-squelettiques et la peau de subvention (P30 AR042689 au Dr Thomas Kupper S.; Hôpital Brigham and Women, Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
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