Summary
דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על משטחים תא האנדותל.
Abstract
E-selectin הוא חלבון מסוג 1 הממברנה על לתאי אנדותל כלי הדם המסייעת ליזום גיוס במחזור leukocytes לרקמות, דלקת עורית העצם. E-selectin הביטוי הוא מכונן על microvessels עורי ועצמות והוא ועין מתנהלת על ידי תומכי ציטוקינים דלקתיים, כגון IL-1α / ו TNF-α, על microvessels ברקמות דלקתיות. קולטן זה לקטינים מתווכת אינטראקציות מחייב חלש עם נגד קולטן ligands פחמימות על leukocytes במחזור, שתוצאתה התנהגות מתגלגל אופייני. בגלל אינטראקציות אלה להקדים אירועים דבק יציב יותר פעילות diapedesis, אפיון של פעילות מתגלגל ליקוציט וזיהוי של E-selectin ligands ליקוציט כבר המטרות העיקריות בלימודי סחר דלקת ליקוציט ו ו בפיתוח ותרופות אנטי דלקתיות (1-5) . הכוונה של דו"ח זה היא לספק תיאור ויזואלי, מקיף של הטכנולוגיה ביותר בשימוש נרחב לחקר E-selectin E-selectin אינטראקציות ליגנד בתנאים פיזיולוגיים זרימת הדם. המעבדה שלנו בשיתוף עם המרכז למחלות עור הרווארד מחקר משתמשת המדינה-of-the-art מקבילות צלחת קאמרית תזרים מנגנון מלווה להדמיה דיגיטלית ותוכנות הקלטה חדשה, שקל-Elements. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לנתח אירועים הידבקות בזמן אמת להדמיה על המסך, כמו גם פעילות שיא מתגלגל בפורמט וידאו. הידבקות תא פרמטרים, כגון גלגול, תדירות התנגדות גזירה ומחייבת / קשירה יעילות, מחושבים באמצעות תוכנת שקל, יסודות, מיוצא גיליון אלקטרוני של Excel ו - נתון ניתוח סטטיסטי. בהפגנה שהוצגו כאן, אנחנו עובדים הקאמרית מקבילות צלחת תזרים לחקור E-selectin תלויי פעילות מתגלגל ליקוציט על חיים אנושיים לתאי מח עצם האנדותל (hBMEC). האדם hematopoietic KG1a ובתאים, המבטאים רמה גבוהה של ליגנד E-selectin, שימשו מודל ליקוציט שלנו, תוך תא הנציח hBMEC קו, HBMEC-60 תאים, שימש מודל תא האנדותל שלנו (6). כדי לגרום לדמות ביטוי יליד E-selectin בחדר זרימה, HBMEC-60 תאים הופעלו הראשון עם IL-1. מצגת וידאו שלנו הראו כי במקביל הצלחת ניתוח תזרים היא שיטה מתאימה ללימוד E-selectin בתיווך פיזיולוגי פעילויות מתגלגל ליקוציט וכי אפיון פונקציונלי של ליגנד E-selectin לויקוציטים (ים) בחדר זרימה ניתן לקביעה על ידי יישום פרוטאז או glycosidase digestions.
Protocol
1. הכנת hBMEC (HBMEC-60 תאים) monolayer על צלחות פטרי עבור לשכת Flow
- מעיל 35 x 10mm רקמות תרבות מנות עם 2ml של פיברונקטין 20μg/ml (ב PBS) לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 3 שעות ב 37 ° C.
- לשאוב פתרון פיברונקטין מן המנות ולהוסיף 1.5 x10-60 HBMEC 5 תאים [בינוני עם 199 HEPES & גלוטמין, 10% FBS, סרום אנוש 10%, 5 יחידות / מ"ל הפרין, 1ng/ml גידול רקומביננטי אנושי גורם פיברובלסטים, 1% פניצילין- סטרפטומיצין] כדי בצלחת ולאפשר להם לגדול מפגש> 90%. (זה לוקח 2 ימים)
- לשאוב התקשורת צמיחה, כדי להסדיר מעלה E-selectin הביטוי, להוסיף בינוני טרי עם 50ng/mL IL-1β במשך 4-6 שעות. Monolayers Cell מוכנים כעת עבור מתגלגל assay. כדי לחסום דואר selectin לתפקד, נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב (שיבוט BBIG-E4 (5D11)) ניתן להוסיף את 20μg/ml עבור ~ 1 שעות בשעה 37 ° C.
2. הכנת האדם hematopoietic KG1a ובתאים עבור לשכת Flow
- האדם hematopoietic KG1a ובתאים הם גדלו confluency (1x10 6 תאים / מ"ל) ב RPMI-1640 עם גלוטמין ו -10% FBS / 1% פניצילין, סטרפטומיצין והם pipetted ישירות מהבקבוק לשימוש assay תא הזרימה.
- מספר תא מחושב באמצעות hemacytometer ואז התאים מחדש מושעה ב 1 x 10 6 תאים / מ"ל HBSS עם HEPES 10mm (H / H הצפת) ו 2mm CaCl 2
- תאים מאוחסנים על הקרח עד לשימוש assay.
3. הכנת, לשכת מיקרוסקופ תזרים מקבילי ו-פלייט משאבת מזרק (איור 1)
באיור 1. איור של ניתוח במקביל-פלייט לשכת זרימה. מיקרוסקופ הפוך, משאבת מזרק הרווארד, המחשב / מצלמה מקבילות צלחת קאמרית תזרים ממוקמים להסדר אופטימלי לניתוח תא יעיל לשחזור.
- הפעלת כוח מקור אור מיקרוסקופ כוח הפוכה לשאוב מזרק ובחר את המטרה 10X על המיקרוסקופ.
- מקום 50 מ"ל צינור חרוטי בעריסה ולמלא עם H / H ו 2mm CaCl 2.
- מקום 5 מ"ל מבחנות פלסטיק ב מבחן בעל צינור מתחת צינור 50 מ"ל חרוטי
- המקום 60mL מזרק בתוך מזרק משאבה (הקפד כי הן הבוכנה והגוף של מזרק הן מאובטח).
- צרף 3-דרך להפסיק את הזין עד הסוף של מזרק 60mL ולצרף מזרק 5 מ"ל על הזין לעצור 3-way.
- תזרים מקבילי מקום לשכת המנגנון (GlycoTech, Inc) על הבמה מיקרוסקופ עם צינורית הזנה ימינה, צינור הפלט שמאלה צינור ואקום האחורי.
- צרף צינורות ואקום ואקום שסתום אוויר פתוח על מנת לאפשר מנגנון צלחת במקביל לדבוק הבמה. (זה בדיקות אם חצאית ואקום על החדר זרימת אוויר הוא חזק.) בטל שסתום אוויר.
- צרף פלט קו צינורות (בצד שמאל של המיקרוסקופ) ל 3-way stop-הזין. Apparatus מוכן עכשיו עבור הצבת בצלחת HBMEC-60 monolayer.
- HBMEC-60 פלייס monolayer צלחת ומניחים על מרכז מיקרוסקופ.
- הפעל ואקום בעמדה קאמרית תזרים מנגנון מעל צלחת כזה צלחת monolayer נמצא במרכז.
- בעדינות להוריד את מנגנון התא זרימה לצלחת HBMEC-60 monolayer ולאפשר קאמרית מנגנון זרימת יניקה למטה. (לא צריך להיות שום קולות של אוויר להימלט ובשלב זה ייתכן שיהיה עליך ללחוץ על תא כדי לדחוס את אטם גומי).
- לאחר ואקום הוקם, קלט צינור מקום (מצד ימין) לתוך צינור המכיל 50 מ"ל חרוטי H / H עם 2mm CaCl 2.
- פתח 3-way stop-הזין כדי לאפשר זרימה לתוך המזרק 60mL ומשאבה מקום "מצב המשאבה."
- כדי להסיר אוויר קלט / פלט קווים מבלי להרים את התאים על הצלחת, השתמש משאבת מזרק להגדיר 2mL/minute למלא את הצינור הצריכה, ולאחר מכן להגדיר במהירות 0.5 מ"ל / דקה לפני הנוזל מגיע המנגנון. זה הכרחי כדי להקים ממשלה זו בזהירות ולהימנע בועות אוויר אשר יהיה להרים את monolayer מן הצלחת.
- לאחר נוזל נתפסת לנוע לתוך המזרק 60ml, לשכת זרימה משאבת מזרק כבר דרוך ובית הנבחרים תזרים מוכן לשימוש. להגדיר את זה יחזור על עצמו עבור כל מחזור התא קלט עבור כל צלחת חדשים לפי הצורך.
4. לכידת אירועים רולינג ליקוציט באמצעות אלמנטים ש"ח
- פתח ש"ח אלמנטים על שולחן העבודה.
- לחץ על "לשחק" סמל תמונה חיה. חשיפה אוטומטית תאפשר לכם לראות את הצלחת יותר קל עכשיו חשוב להתמקד.
- הקפד מיקרוסקופ ממוקדת כהלכה על monolayer התא.
- ממוקד פעם להגדיר מחדש החשיפה לאור מסגרת / שנייה ולהתאים 1 על המיקרוסקופ. התמונה אמורה להופיע על המחשב כבר לא יהיה גלוי עינית המיקרוסקופ בשל רמת תאורה נמוכה. היסטוגרמה האור אז יכול להיות מודעהכשהם באים להסיר חשיפה רקע או לשפר בהירות התא.
- לחץ על סל 2x2 או בן חיים לקבל תמונה כי הוא אידיאלי עבור לכידת סרט
- לחץ על "מאקרו" על שורת התפריטים ובחר "לכתוב לנמל"; לבחור יציאת "COM3", ו - "פתוח". (זה פותח את יציאת לתאם עם משאבה את המזרק.
- פיפטה 1mL ההשעיה תא KG1a לתוך המבחנה 5 מ"ל ליד קו צינורות הזנה ואז במקום קו צינורות הזנה לתחתית המבחנה.
- עבור אל בשורת התפריטים, לחץ על "לכידה", "זמן לשגות הרכישה".
- התפריט החדש יופיע. בחר פרוטוקול שנמשך 210 שניות, זה אורך התוכנית מתגלגל על HBMEC-60 תאים. (כל שלב מתוכנת לצלם בכל שנייה למשך פרוטוקול המשאבה. הוא גם הקים לשלוח פקודה דרך נמל COM3 כדי להפעיל את המשאבה.) אם זמן לשגות נקטע, המשאבה לא יפסיקו בכוחות עצמו וצריך לאפס. לחץ על ביטול כדי לחזור לחיות התמונה.
- הגדר את משאבת מזרק כדי "מצב תוכנית" על פי הוראות ההפעלה. (מצב התוכנית מאפשרת תכנות ידני של ספיקות ספציפיים (כלומר רמות הלחץ גזירה) להיות הנחילה בתוך החדר ולהכתיב אינטראקציות KG1a תא מעל monolayer HBMEC-60 תאים.) הגדרות עבור תא KG1a מתגלגל על תאים hBMEC היו כדלקמן 4.2 dynes / 2 ס"מ על 45 s, 0.3 dynes / 2 ס"מ על 60 s, ומגבירה בשלבים כל 15 שניות עד למקסימום של 4.2 dynes / 2 ס"מ
- וול מתח גזירה (W רח') בחדר היה מחושב על פי המשוואה הבאה: W = רחוב 6μQ / 2 ב, שם μ הוא צמיגות מוערך של התקשורת (0.0076 P), ש הוא קצב זרימת volumetric ב מ"ל / s, a הוא גובה ערוץ (עובי אטם) ב ס"מ (0.03 ס"מ), ואילו b הוא רוחב ערוץ ס"מ (0.5 ס"מ). שיעורי זרימה הוסדרו באמצעות מצב תוכנית של משאבת את המזרק.
- מיקרוסקופ והמחשב מוכנים כעת ללכוד זמן לשגות צילום. לחץ על "להתחיל לרוץ" על המחשב כדי להתחיל ברכישת נתונים. בעת הפעלת התוכנית, הקפד להוסיף מדיה במבחנה המכילה תאים KG1a על מנת לשמור על צינורות קלט / פלט בינוני מלא (וודא שאין בועות אוויר).
5. התלות של Sialylation מסוף גליקופרוטאין Surface עבור Cell KG1a E-selectin בתיווך 5. רולינג (איור 2: קטעי וידאו קליפים של 5.1-5.5)
- Assaying של התא KG1a מתגלגל על הלא מגורה HBMEC-60 תאים. (שליטה שלילי) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות אי - IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל.
- Assaying של התא KG1a מתגלגל על HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β. (E-selectin תלות מלאה) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל.
- Assaying של התא KG1a מתגלגל על HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β ואז נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב. (E-selectin תלות מלאה) תאים KG1a הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL- 1β-מגורה HBMEC-60 pretreated עם נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב, כמתואר לעיל.
- Assaying של sialidase-מתעכל תא KG1a מתגלגל על IL-1β-מגורה HBMEC-60. תאים KG1a pretreated עם 0.1U/ml Vibrio Cholerae neuraminidase עבור 1 שעות בשעה 37 ° C היו מוכנים ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל.
- Assaying של פרוטאז-מתעכל תא KG1a מתגלגל על IL-1β-מגורה HBMEC-60. תאים KG1a pretreated עם פרוטאז, ברומלין 0.2U/ml עבור 1 שעות בשעה 37 ° C, הוכנו ותמלא תא זרימה יותר לחיות IL-1β-מגורה HBMEC-60 כפי שתואר לעיל.
6. ניתוח ש"ח-Elements-Captured תאים KG1a ו Graphing של תא KG1a נתונים רולינג
- לאחר רצף הזמן היא רכשה, לשמור את הנתונים.
- עבור לכרטיסייה "למדוד" על שורת התפריטים ובחר "להגדיר סף". העבר ברים כך התאים הרצוי נצבעים באדום. בחר "כל התמונות" אז "בסדר". כל רצף זמן לשגות עכשיו צריך להיות שונה עם גלוי תאים המתגלגל אדום.
- יש להקליק על "מדוד" ובחר "הגבלות". (הגבלות לאפשר למשתמש להוציא חפצים thresholded שאינם מייצגים תאים מתגלגל. זה בעיקר רקע נוצר על ידי monolayer HBMEC-60.) בחר "שטח" ו דקות קלט וערכי מקסימום באזור עבור תאים מתגלגל. חזור על שלב זה עבור "הארכה" ו "מעגליות".
- בחר "למדוד" ובחר "ליצור בינאריים באמצעות הגבלות", ולהגדיר את ערכי הגבלה כדי לייעל ש"ח-Elements תוכנה לזיהוי של תאים מתגלגל על monolayer של HBMEC-60 תאים.
- חזור אל "למדוד", בחר "נתונים שדה", ולאחר מכן בחר "איפוס נתונים". סגור את התפריט.
- חזור אל "מדוד" ו select "שדה סריקה".
- "מדוד", פתח: "הנתונים שדה", בחר "מספר אובייקטים או" ולאחר מכן לבחור "כל השדות" ולייצא נתונים אל Microsoft Excel.
- בחר "נתונים ברורים" להכין ש"ח, אלמנטים רכישת תא איסוף הנתונים הבאה.
תוצאות:
איור 3. Parallel-פלייט לשכת ניתוח תזרים פעילות E-selectin מחייב על תאים KG1a. KG1a תאים שטופלו sialidase או פרוטאז נותחו עבור מתגלגל על יעילות monolayers של HBMEC-60 תאים טרום שטופלו IL-1β. בקרה שלילית מתגלגל הניסויים נערכו גם על ידי ניתוח התא KG1a מתגלגל על אי - IL-1β-מגורה HBMEC -60 תאים או על IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים שטופלו נטרול אנטי אנושי E-selectin מואב (5D11). גלגול תדרים סלולריים בוצעו בשלושה עותקים ונותחו באמצעות תוכנת שקל-Elements. (* משמעות סטטיסטית p <0.001)
בדו"ח וידאו מבוסס הזה, סיפקנו תיאור ויזואלי כיצד לנתח ליקוציט - אינטראקציות תא האנדותל תחת פיזיולוגי בתנאי עקה גזירה. בפרט, ניתחנו את התפקיד של E-selectin - E-selectin ligands בתיווך קשירה ליקוציט וגלגול, התנהגות דבק הכרחי של מחויבות משני פעילויות מחייב יותר יציב באמצעות קולטנים, כגון integrins ואת הקולטנים hyaluronan. שימוש קאמרית מקבילות צלחת תזרים מותאם לשימוש עם מיקרוסקופ הפוכה, משאבת הרווארד מזרק, מצלמת וידאו ומחשב / תא חומרה הרכישה, ערכנו ניסויים שבה E-selectin ליגנד + תאים KG1a שימשו מודל ליקוציט שלנו תאים hBMEC (HBMEC- 60) מגורה עם ציטוקינים הפרו דלקתיים, IL-1β, שימשו E-selectin המודל האנושי + תא האנדותל (1-6). כפי שדווח בעבר, צפינו חזקים תא KG1a מתגלגל על IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים על פני טווח של רמות הלחץ גזירה באופן E-selectin תלויי (איור 3) (הבדל משמעותי סטטיסטית בהשוואה תא KG1a מתגלגל על אי - IL-1β HBMEC-60 מגורה תאים). בקרות שליליות, שכללה תא KG1a מתגלגל על אי - IL-1β-מגורה HBMEC-60 תאים או על IL-1β-מגורה HBEMC-60 תאים pretreated עם מב אנטי אנושי E-selectin, בוצעו במקביל כדי להדגים את התלות גירוי ציטוקינים ו-E-selectin ביטוי לפעילות מתגלגל (איור 3). יתר על כן, ניתוח מתגלגל של תאים KG1a pretreated עם Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) או עם ברומלין, פרוטאז הלא ספציפית ידוע לעכל E-selectin משטח ליגנד גליקופרוטאין, הדגיש את החשיבות של שאריות מסוף חומצה sialic ו גליקופרוטאין משטח ליגנד E-selectin פעילות (2,3).
Discussion
במקביל, צלחת לחדר ניתוח תזרים הוא התמחה מערכת assay חוץ גופית המשמשת ללמוד ליקוציט - אינטראקציות דבק אנדותל בתנאים מתח גזירה דומה לאלה הנחילה על פני השטח של ורדיד שלאחר נימי. כפי שמתואר כאן במצגת ויזואלית שלנו, אנחנו מדגימים את הערך של מערכת זו על חקירת תפקידו של E-selectin - E-selectin ligands בתיווך קשירה ליקוציט, מתגלגלים על פני השטח של כלי הדם האנדותל הופעל. כמו כן, אנו חושפים את היישום של glycosidase פרוטאז, טיפולים נוגדן חסימת הבהרת תפקידה של selectin-E ו ligands שלה במערכת זו. ניתוחים אלה הם לשעתקו מאוד לעזור להקים בסיס ניסיוני לחקר E-selectin - E-selectin פונקציה ליגנד in vivo.
בנוסף ללימוד הידבקות התא עם monolayers של ציטוקינים המופעל לתאי אנדותל כלי הדם (עורק הטבור hBMEC או אדם או עורי לתאי אנדותל כלי הדם), מבחני יכול להתבצע באמצעות מטוהרים רקומביננטי אנושי E-selectin או E-selectin-איג מולקולות chimeric כמו מצע עבור הידבקות התא. אינטראקציות דבק אחרים בתיווכם לויקוציטים (L-) ו-selectin טסיות דם (P)-selectin יכול להיות גם assayed באמצעות צלחת מקבילות קאמרית טכנולוגיה לזרום. על ידי שינוי סוג המצע תא monolayer / חלבון או של לויקוציטים קלט / selectin-transfectant מודלים תא, החוקרים יכולים ללמוד את התפקיד של אינטראקציות אלה בתנאים מתח פיזיולוגי גזירה.
Disclosures
המחברים אין ניגודי אינטרסים או גילויים.
Acknowledgments
המימון לפרויקט זה סופק על ידי בפרס האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מלומד, (06-024-01-CSM צ'רלס ג'דימיטרוף); מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן מענק (RO1CA118124 צ'רלס ג'דימיטרוף); ו המכונים הלאומיים לבריאות / לאומי של דלקת מפרקים השלד והשרירים ועל מחלות עור מענק (P30 AR042689 ד"ר תומס ס 'קופר, מבית החולים בריגהאם לנשים, בוסטון, מסצ'וסטס).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
