Summary
Questo rapporto fornisce una rappresentazione visiva di piatti paralleli analisi del flusso della camera per lo studio delle interazioni tra leucociti endoteliale sotto fisiologiche sollecitazioni di taglio. Questo metodo è particolarmente utile per indagare il ruolo di endoteliale (E)-selectina e leucociti E-selectina ligandi che leucociti innescare rotolamento sulla superficie delle cellule endoteliali.
Abstract
E-selectina è un tipo-1 proteina presente sulla membrana delle cellule endoteliali microvascolari che aiuta a iniziare il reclutamento dei leucociti circolanti nei tessuti cutanei, ossei e infiammato. E-selectina espressione è costitutiva sul microcircolo cutaneo e ossa ed è inducibile da citochine pro-infiammatorie, quali IL-1α / e TNF-α, il microvasi nei tessuti infiammati. Questo recettore lectina media deboli interazioni di legame con carboidrati contro-recettore ligandi sui leucociti circolanti, che si traduce in un comportamento caratteristico di rotolamento. Poiché queste interazioni precedere eventi adesivo più stabile e attività diapedesi, caratterizzazione dei leucociti attività di rotolamento e l'identificazione dei leucociti E-selectina ligandi sono stati gli obiettivi principali degli studi di traffico dei leucociti e l'infiammazione e lo sviluppo di terapie anti-infiammatorie (1-5) . L'intento di questo rapporto è di fornire una visuale, descrizione completa della tecnologia più diffusa per lo studio di E-selectina E-selectina interazioni ligando in condizioni fisiologiche del flusso sanguigno. Il nostro laboratorio in collaborazione con il Centro di Ricerca Malattie della pelle Harvard utilizza un state-of-the-art a piatti paralleli apparato camera di flusso accompagnato da visualizzazione digitale e software di nuova registrazione, NIS-Elements. Questa tecnologia ci permette di analizzare gli eventi adesione in tempo reale per la visualizzazione sullo schermo così come l'attività di registrazione in sequenza in un formato video. Parametri di adesione cellulare, come la frequenza di rotazione, la resistenza al taglio e rilegatura / tethering efficienza, sono calcolati con NIS-Elements, esportati in un foglio Excel e sottoposti ad analisi statistica. Nella dimostrazione qui presentati, abbiamo impiegato i piatti paralleli camera di flusso per indagare E-selectina-dipendente l'attività dei leucociti che rotola su cellule di midollo osseo umano vivente endoteliale (hBMEC). Umane ematopoietiche cellule progenitrici KG1a, che esprimono un alto livello di E-selectina ligando, sono stati utilizzati come modello dei leucociti, mentre un immortalata linea cellulare hBMEC, HBMEC-60 cellule, è stato utilizzato come modello delle cellule endoteliali (6). Per indurre e simulare nativo E-selectina espressione nella camera di flusso, HBMEC-60 cellule sono stati attivati con IL-1. La nostra presentazione video ha mostrato che a piatti paralleli analisi del flusso è un metodo adeguato per lo studio fisiologico E-selectina-mediata dei leucociti al rotolamento e le attività che la caratterizzazione funzionale dei leucociti E-selectina ligando (s) nella camera di flusso può essere accertata mediante l'implementazione della proteasi o glicosidasi digestioni.
Protocol
1. Preparazione di hBMEC (HBMEC-60 Cell) monostrato in piastre di Petri per camera di flusso
- Cappotto 35 x 10 millimetri di coltura tissulare piatti con 2 ml di fibronectina 20μg/ml (in PBS) notte a 4 ° C o per 3 ore a 37 ° C.
- Aspirare soluzione fibronectina da piatti e aggiungere 1,5 x10-5 HBMEC 60 celle [Medium 199 con HEPES e glutammina, 10% FBS, 10% siero umano, 5 unità / ml di eparina, 1ng/ml umano ricombinante del fattore di crescita dei fibroblasti, 1% di penicillina- streptomicina] per il piatto e permettere loro di crescere fino a confluenza> 90%. (Questo richiede 2 giorni)
- Aspirare terreni di crescita e, in up-regolazione dell'espressione E-selectina, aggiungere mezzo fresco con 50ng/mL IL-1β per 4-6 ore. Monostrati cellulari sono ora pronti per la laminazione del saggio. Per bloccare la funzione E-selectina, neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab (clone BBIG-E4 (5D11)) possono essere aggiunti in 20μg/ml per ~ 1 ora a 37 ° C.
2. Preparazione di cellule progenitrici emopoietiche umane KG1a per camera di flusso
- Umane ematopoietiche cellule progenitrici KG1a sono cresciuto fino a confluenza (1x10 6 cellule / ml) in RPMI-1640 con la glutamina e il 10% FBS / 1% di penicillina-streptomicina e vengono aggiunti direttamente dal pallone per l'uso in test di flusso da camera.
- Numero di cellulare è calcolato utilizzando un emocitometro e poi le cellule sono risospese in 1 x 10 6 cellule / ml in HBSS con 10mM HEPES (H / H Buffer) e 2mM CaCl 2
- Le cellule sono conservati in ghiaccio fino al momento dell'uso in test.
3. Preparazione del Microscopio, Parallel-Plate Chamber portata e di pompa a siringa (Figura 1)
Figura 1. Illustrazione di Parallel-Plate Analisi dei flussi Camera. Microscopio invertito, Harvard pompa a siringa, computer / macchina fotografica e piatti paralleli camera di flusso sono collocati in una disposizione ottimale per l'analisi cellulare efficiente e riproducibile.
- Accendere e fonte di luce per microscopio invertito e il potere di pompa a siringa e selezionare l'obiettivo 10X sul microscopio.
- Luogo 50mL tubo conico in porta e riempire con H / H e 2mM CaCl 2.
- Mettere 5 ml provette di plastica in portaprovettoni sotto il tubo 50mL conica
- Luogo siringa da 60 ml a pompa a siringa (Assicurarsi che sia lo stantuffo della siringa e del corpo sono entrambi protetti).
- Allega 3-way rubinetto alla fine della siringa da 60 ml e attaccare la siringa 5 ml di 3-way rubinetto.
- Posto in parallelo Camera apparato di flusso (GlycoTech, Inc.) sul palco microscopio con tubo di ingresso a destra, il tubo di uscita a sinistra e tubo a vuoto alla schiena.
- Collegare il tubo a vuoto per vuoto e la valvola aperta per consentire apparato piastra parallela di aderire al palco. (Questo test se la gonna a vuoto sulla camera di flusso è a tenuta d'aria.) Spegnere valvola dell'aria.
- Collegare il tubo linea di uscita (a sinistra del microscopio) a 3-way rubinetto. Apparecchio è ora pronto per l'immissione sul HBMEC-60 piastre monostrato.
- Luogo HBMEC-60 piastra monostrato e posto sul centro del microscopio.
- Accendere il vuoto e la posizione dell'apparato camera di flusso sopra la piastra in modo che la piastra monostrato si trova nel centro.
- Abbassare delicatamente l'apparato camera di flusso sul HBMEC-60 piastre monostrato e permettono camera apparato flusso di aspirazione verso il basso. (Non ci dovrebbero essere i suoni di aria che fuoriesce e, a questo punto potrebbe essere necessario applicare una pressione alla camera per comprimere la guarnizione di gomma.)
- Una volta vuoto è stato stabilito, ingresso tubo posto (a destra) nel tubo 50mL conica contenente H / H con 2mM CaCl 2.
- Aperto a 3 vie rubinetto per consentire il flusso all'interno della siringa da 60 ml e la pompa posto in "modalità pompa."
- Per eliminare l'aria da ingresso / uscita senza sollevare le cellule sulla piastra, utilizzare la pompa a siringa fissato a 2mL/minute per riempire il tubo di aspirazione, poi impostare rapidamente a 0,5 ml / minuto appena prima il liquido raggiunge l'apparato. E 'imperativo per primo questo set con cautela ed evitare bolle d'aria che alzerà il monostrato dal piatto.
- Una volta fluido è visto spostare nella siringa da 60 ml, la camera di flusso e pompa a siringa è stato innescato e la camera di flusso è pronto per l'uso. Questo set up verrà ripetuta per ogni corsa cella di input e per ogni nuova piastra necessario.
4. Acquisizione di leucociti Eventi di Rolling utilizzando elementi NIS
- Aprire NIS Elements sul desktop.
- Premere l'icona "play" per l'immagine live. Esposizione automatica ti permetterà di vedere il piatto più semplice per ora e 'importante per la messa a fuoco.
- Assicurarsi che microscopio si concentra correttamente sul monostrato cellulare.
- Una volta concentrata, re-impostare l'esposizione a 1 luce fotogrammi / secondo e regolare sul microscopio. L'immagine dovrebbe comparire sul computer e non sarà più visibile nel mirino microscopio a causa del livello di scarsa illuminazione. Istogramma della luce può essere annuncioportato alla giusta rimuovere esposizione dello sfondo o migliorare la chiarezza delle cellule.
- Clicca su bin 2X2 o Bin Live per ottenere un'immagine che è l'ideale per la registrazione di filmati
- Clicca su "macro" sulla barra dei menu e selezionare "scrivi a porta", selezionare la porta "COM3" e "aperto". (Questo apre la porta a coordinarsi con la pompa a siringa.
- Pipettare 1 ml di sospensione cellulare KG1a nella provetta 5 ml vicino alla linea di tubi d'ingresso e poi posto tubi linea di ingresso al fondo della provetta.
- Vai alla barra dei menu, cliccare su "Capture", "time-lapse acquisizione."
- Un nuovo menu pop-up. Selezionare il secondo protocollo della durata di 210, questa è la durata del programma per la laminazione a HBMEC-60 celle. (Ogni fase è programmata per scattare una foto ogni secondo per tutta la durata del protocollo pompa. E 'inoltre configurato per inviare un comando tramite la porta COM3 per avviare la pompa.) In caso di time-lapse è interrotto, la pompa non si ferma da solo e deve essere ripristinato. Premere Annulla per tornare a vivere immagine.
- Impostare la pompa a siringa a "Modalità di programma", secondo il manuale di istruzioni. (Modalità di programmazione permette una programmazione manuale delle portate specifiche (ad esempio i livelli di stress di taglio) di essere impartito all'interno della camera e dettare le interazioni delle cellule KG1a il monostrato HBMEC-60 cell.) Impostazioni per cellulari KG1a rotola su cellule hBMEC sono stati i seguenti 4,2 dyne / cm 2 per 45 s, 0,3 dyne / cm 2 per 60 s, ed aumenta gradualmente ogni 15 s ad un massimo di 4,2 dyne / cm 2
- Muro sforzo di taglio (W st) nella camera è stato calcolato secondo la seguente equazione: W st = 6μQ / a 2 b, dove μ è la viscosità stima dei media (0,0076 P), Q è la portata volumetrica in ml / s, una è l'altezza del canale (spessore della guarnizione) in cm (0,03 cm) e b è la larghezza del canale in cm (0,5 cm). Le portate sono state regolate utilizzando la modalità programma della pompa a siringa.
- Microscopio e computer sono ora pronti a catturare time-lapse fotografia. Premere il tasto "Start Esegui" sul computer per iniziare l'acquisizione dati. Durante l'esecuzione del programma, assicurarsi di aggiungere supporto per la provetta contenente le cellule KG1a al fine di mantenere l'ingresso / uscita tubi pieni di media (Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria).
5. Dipendenza della Sialylation Terminale e Glicoproteina di superficie per E-selectina-mediato dalle cellule KG1a 5. Laminazione (Figura 2; Clip Video di 5,1-5,5)
- Saggio della cellula KG1a rotolamento sulla non-stimolata HBMEC-60 cellule. (Controllo negativo), le cellule KG1a sono stati preparati e infuse nella camera di flusso nel vivo non-IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra.
- Saggio della cellula KG1a rotolamento su HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β. (E-selectina-dipendenza di controllo) KG1a cellule sono state preparate e infusa nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra.
- Saggio della cellula KG1a rotolamento su HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β e poi neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab. (E-selectina-dipendenza di controllo) KG1a cellule sono state preparate e infusa nella camera di flusso su vivere IL- 1β-stimolato HBMEC-60 pretrattati con neutralizzanti anti-umano E-selectina moab come descritto sopra.
- Saggio della sialidasi-digerito cellule KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60. KG1a cellule pretrattate con 0.1U/ml Vibrio neuraminidasi Cholerae per 1 ora a 37 ° C sono stati preparati e infuse nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra.
- Saggio della proteasi digerito cellule KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60. Cellule KG1a pretrattati con proteasi, bromelina 0.2U/ml per 1 ora a 37 ° C, sono stati preparati e infuse nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra.
6. Analisi di NIS-Elements-Catturato Cellule KG1a e grafico di Cell KG1a dati di Rolling
- Dopo la sequenza temporale viene acquisita, salvare i dati.
- Vai alla scheda "misura" nella barra dei menu e selezionare "definire soglia." Spostare le barre in modo che le cellule desiderate sono colorati in rosso. Selezionare "tutte le immagini" e poi "Ok". L'intero time-lapse sequenza dovrebbe ora essere modificato con visibile globuli rossi al rotolamento.
- Vai su "Misura" e seleziona "restrizioni". (Restrizioni consentire all'utente di escludere gli oggetti thresholded che non rappresentano cellule di rotolamento. Questo è principalmente sfondo creato dal HBMEC-60 monostrato.) Selezionare "area" e min di ingresso e valori massimi per l'area per le cellule di rotolamento. Ripetere questo passaggio per "allungamento" e "circolarità".
- Selezionare "misura" e selezionare "creare binario utilizzando le restrizioni", e impostare i valori di restrizione per ottimizzare NIS-Elements software di riconoscimento delle cellule che rotola su monostrato di HBMEC-60 cellule.
- Torna alla "misura", selezionare "i dati di campo", quindi selezionare "Dati reset". Chiudere questo menu.
- Torna a "misura" e seselezionare "campo di scansione".
- Aperto "Misura", "Campo dati", selezionare "numero o oggetti" e poi selezionare "tutti i campi" ed esportare dati in Microsoft Excel.
- Selezionare "dati chiari" per preparare NIS-Elements acquisizione di cellule per la prossima raccolta dei dati.
Risultati:
Figura 3. Parallel-Plate Chamber Analisi del flusso di E-selectina-Binding attività sulle cellule KG1a. KG1a cellule trattate con sialidasi o proteasi sono stati analizzati per la laminazione efficienza su monostrati di HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β. Controllo negativo rotolamento esperimenti sono stati condotti anche attraverso l'analisi delle cellule KG1a rotolamento sulla non-IL-1β-stimolata HBMEC -60 cellule o su IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule trattate con neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab (5D11). Frequenze di laminazione delle cellule sono stati eseguiti in triplice copia ed analizzati con NIS-Elements. (* Significatività statistica p <0,001)
In questo video basato su report, abbiamo fornito una rappresentazione visiva di come analizzare i leucociti - le interazioni delle cellule endoteliali in condizioni fisiologiche sollecitazioni di taglio. In particolare, abbiamo analizzato il ruolo di E-selectina - E-selectina ligandi nella mediazione tethering leucociti e laminazione, un comportamento adesivo necessaria per l'impegno dei secondaria attività più stabile legame attraverso i recettori, come le integrine e recettori acido ialuronico. Utilizzando il parallelo-piastra camera di flusso concepiti per essere utilizzati con un microscopio invertito, Harvard pompa a siringa, videocamera e computer / cellulare hardware di acquisizione, abbiamo condotto esperimenti in cui E-selectina ligando + cellule KG1a sono state usate come il nostro modello di leucociti e cellule hBMEC (HBMEC- 60) stimolati con citochine pro-infiammatorie, IL-1β, sono state usate come la nostra E-selectina + modello umano delle cellule endoteliali (1-6). Come riportato in precedenza, abbiamo osservato robusta cellula KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule in un range di livelli di stress di taglio in modo E-selectina-dipendente (Figura 3) (differenza statisticamente significativa se confrontata con cella KG1a rotola su non-IL-1β HBMEC-60 stimolate le cellule). Controlli negativi, che consisteva di cellule KG1a rotolamento sulla non-IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule o su IL-1β-stimolata HBEMC-60 cellule pretrattate con anti-umano E-selectina mAb, sono stati eseguiti in parallelo per dimostrare la dipendenza di stimolazione citochine ed E-selectina espressione per l'attività di laminazione (Figura 3). Inoltre, l'analisi laminazione di cellule KG1a pretrattate con Vibrio cholerae neuraminidasi (sialidasi) o con la bromelina, un non-specifico della proteasi noto per digerire E-selectina superficie ligando glicoproteina, ha sottolineato l'importanza dei residui di acido sialico terminale e glicoproteina di superficie per l'E-selectina ligando attività (2,3).
Discussion
Piatti paralleli analisi camera di flusso è un sistema specializzato in test in vitro utilizzati per lo studio dei leucociti - interazioni adesive endoteliale in condizioni di stress di taglio simili a quelli impartiti sulla superficie di un post-capillari venule. Come illustrato qui nella nostra presentazione visiva, dimostriamo il valore di questo sistema per indagare il ruolo di E-selectina - E-selectina ligandi nella mediazione tethering leucociti e rotolando sulla superficie dell'endotelio microvascolare attivata. Ci rivelano anche l'applicazione della proteasi, glicosidasi e trattamenti anticorpi blocco per chiarire il ruolo di E-selectina e dei suoi ligandi in questo sistema. Queste analisi sono altamente riproducibili e aiutare a formare una base sperimentale per lo studio di E-selectina - E-selectina funzione di legante in vivo.
Oltre a studiare l'adesione cellulare con monostrati di cellule microvascolari citochina-attivati endoteliale (vena ombelicale hBMEC o umana o per assorbimento cutaneo delle cellule endoteliali microvascolari), le analisi possono essere eseguite utilizzando umana ricombinante purificata E-selectina o molecole chimeriche E-selectina-Ig come substrato per l'adesione cellulare. Interazioni adesive altri mediato attraverso leucociti (L-)-selectina e delle piastrine (P)-selectina possono essere analizzati utilizzando la tecnologia a piatti paralleli camera di flusso. Variando il tipo di cellule monostrato / proteine substrato o di leucociti ingresso / selectina-transfectant modelli cellulari, i ricercatori possono studiare il ruolo di queste interazioni in condizioni fisiologiche sollecitazioni di taglio.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo progetto è stata fornita da un americano Society Scholar Award Cancer Research, (06-024-01-CSM di Charles J. Dimitroff), un National Institutes of Health / National Cancer Institute di sovvenzione (RO1CA118124 di Charles J. Dimitroff) e uno National Institutes of Health / National Institute of Arthritis e muscolo-scheletrico e malattie della pelle di sovvenzione (P30 AR042689 il Dr. Thomas S. Kupper, Brigham and Women Hospital, Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
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