Summary
В настоящем докладе содержится визуальное изображение плоского анализ камеру поток для изучения взаимодействий лейкоцитов эндотелия в физиологических напряжения сдвига. Этот метод особенно полезен для исследования роли эндотелия (Е)-селектина и лейкоцитов E-селектина лигандов, которые вызывают лейкоцитов прокатки на поверхности эндотелиальных клеток.
Abstract
E-селектина является одним из видов-1 мембранного белка на микрососудистых эндотелиальных клеток, которые помогают начать вербовку циркулирующих лейкоцитов к кожной, костной и воспаленных тканей. E-селектина выражение учредительных на кожных и костных микрососудов и индуцибельной по провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1α / и ФНО-α, на микрососуды в воспаленных тканях. Это лектина рецепторов опосредует слабой связи взаимодействия с углеводами контр-рецепторов лигандами на циркулирующие лейкоциты, что приводит к характерным подвижного поведения. Потому что эти взаимодействия предшествовать более стабильной клей событий и диапедез деятельности, характеристика лейкоцитов подвижной активности и выявление лейкоцитов E-селектина лигандами основных целей при исследовании лейкоцитов торговли и воспаление и в развитии противовоспалительные терапии (1-5) . Цель данного доклада заключается в предоставлении визуальных, подробное описание наиболее широко используемых технологий для изучения E-селектина Е-селектина взаимодействия лигандов в физиологических условиях кровотока. Наша лаборатория совместно с болезнями Гарвардского исследовательского центра кожи использует состоянии современных плоского потока камера аппарата сопровождается цифровой визуализации и новое программное обеспечение записи NIS-Elements. Эта технология позволяет анализировать сцепление событий в реальном времени на экране визуализации, а также записи подвижного деятельность в видео формате. Адгезия клеток параметров, таких как прокатка частота, сопротивление сдвигу и обязательным / привязывать эффективности, рассчитываются с NIS-Elements программное обеспечение, экспортировать в таблицу Excel и подвергается статистическому анализу. В демонстрации, представленные здесь, мы использовали плоского потока камера для исследования E-селектина зависит от лейкоцитов подвижной активности на живые костного мозга человека эндотелиальных клеток (hBMEC). Человек гемопоэтических предшественников KG1a клетки, которые экспрессируют высокий уровень E-селектина лиганд, были использованы в качестве наших лейкоцитов модели, а увековечили линии hBMEC клетки, HBMEC-60 клеток, была использована в качестве нашей модели клетки эндотелия (6). Для стимулирования и имитировать родную E-селектина выражение в проточную камеру, HBMEC-60 клетки впервые были активированы с IL-1. Наши видео-презентации показали, что плоский анализа потока является подходящим методом для изучения физиологических E-селектин-опосредованной лейкоцитов подвижной деятельности, и что функциональная характеристика лейкоцитов E-селектина лиганд (ы) в проточную камеру может быть установлено путем реализации протеазы или гликозидазы пищеварения.
Protocol
1. Подготовка hBMEC (HBMEC-60 ячеек) монослоя на чашки Петри для потока палаты
- Шерсть 35 х 10 мм, ткань-культуры блюд с 2 мл фибронектина 20μg/ml (в PBS) в течение ночи при температуре 4 ° С или в течение 3 часов при 37 ° C.
- Аспирируйте фибронектина решение от блюда и добавляют 1,5 x10 5 HBMEC-60 клеток [Средний 199 с HEPES и глютамина, 10% FBS, 10% человеческой сыворотки, 5 ед / мл гепарина, 1ng/ml рекомбинантный человеческий фактор роста фибробластов, 1% пенициллин- Стрептомицин] на блюдо и дать им возможность вырасти до> 90% слияния. (Это занимает от 2 дней)
- Аспирируйте питательной среды и, в до-регулировать E-селектина выражения, добавьте свежую среду с 50ng/mL ИЛ-1β в течение 4-6 часов. Сотовые монослоев теперь готовы для прокатки теста. Чтобы заблокировать E-селектина функции, нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава (клон BBIG-E4 (5D11)) могут быть добавлены в 20μg/ml для ~ 1 час при температуре 37 ° C.
2. Подготовка по правам гемопоэтических предшественников KG1a Клетки для потока палаты
- Гемопоэтических клеток человека KG1a предшественников выращивают до слияния (1х10 6 кл / мл) в RPMI-1640 с глютамином и 10% ЭТС / 1% пенициллина стрептомицин и пипеткой прямо из колбы для использования в потоке анализа камеры.
- Сотовые количество рассчитывается hemacytometer а затем клетки ресуспендировали в 1 х 10 6 клеток / мл в HBSS 10 мМ HEPES (H / H буфера) и 2 мМ CaCl 2
- Клетки хранятся на льду до использования в анализе.
3. Подготовка Микроскоп, плоского палаты потока и шприцевой насос (рис. 1)
Рисунок 1. Иллюстрация плоского Анализ палаты Flow. Инвертированный микроскоп, Гарвардский шприцевой насос, компьютер / камеры и плоского потока камеры помещаются в оптимальное расположение для эффективного и воспроизводимого клеточного анализа.
- Включите питание и источником света для инвертированного микроскопа и власть шприцевой насос и выберите 10X Цель на микроскопе.
- Место 50 мл коническую трубку в держатель и залейте H / H и 2 мМ CaCl 2.
- Место 5 мл пластиковые пробирки в пробирку, держатель ниже 50 мл коническую трубку
- Место 60 мл шприца в шприцевой насос (Не забудьте, что оба поршня и тела шприц оба обеспеченных).
- Прикрепить 3-полосная стоп-кран до конца 60 мл шприц и присоедините шприц 5 мл 3-полосная стоп-кран.
- Место Параллельные аппарата палаты Flow (GlycoTech, Inc) на столике микроскопа с входной лампы вправо, выходной лампы на левую и вакуумную трубку к спине.
- Присоединить вакуумный шланг к вакуумной и открытой воздушный клапан, чтобы параллельно пластине аппарата присоединиться к сцене. (Это проверяет, является ли вакуум юбка на поток камера герметично.) Выключите воздушный клапан.
- Присоединить выходной трубкой линии (слева микроскопа) для 3-полосная стоп-кран. Аппарат в настоящее время подготовлен для размещения на HBMEC-60 монослоя пластины.
- Место HBMEC-60 пластины монослоя и положите на центр микроскопом.
- Включите вакуумный и положение аппарата проточную камеру над плитой, что монослой пластина в центре.
- Осторожно опустите аппарат проточную камеру на HBMEC-60 монослоя пластины и позволяют аппарата поток камеры всасывания вниз. (Там должно быть никаких звуков воздух побега и в этот момент вам может понадобиться, чтобы оказать давление на камеру, чтобы сжать резиновую прокладку.)
- После вакуумной было установлено, трубка место входа (справа) в 50 мл коническую трубку с H / H с 2 мМ CaCl 2.
- Открытие 3-полосная стоп-кран, чтобы поступать в 60 мл шприц и поместите насос в "насосном режиме".
- Для удаления воздуха из входных / выходных линий, не поднимая клеток на пластину, используйте шприцевой насос установлен на уровне 2mL/minute заполнить потребления труб, а затем быстро установить до 0,5 мл / мин непосредственно перед жидкости достигает аппарата. Крайне важно, чтобы премьер этого создана тщательно и избежать воздушных пузырьков, снимет монослоя от пластинки.
- Как только жидкость видел переехать в 60 мл шприц, проточную камеру и шприцевой насос быть инициирован и потока камера готова к работе. Это создали будет повторяться для каждого запуска вход клеток и для каждой новой пластинкой необходимо.
4. Захват лейкоцитов Роллинг События использованием NIS элементов
- Открытое NIS элементов на рабочем столе.
- Нажмите кнопку "играть" значок для живого изображения. Автоматическая экспозиция позволит вам увидеть пластины легче сейчас, и очень важно для фокусировки.
- Будьте уверены, что микроскоп фокусируется на клеточный монослой.
- Как только внимание, повторно устанавливать экспозицию с 1 кадр / сек и отрегулируйте свет на микроскоп. Изображение должно появиться на компьютере и не будут видны в микроскоп видоискатель из-за низкого уровня освещенности. Свет гистограмма может быть объявлениеотрегулирована, чтобы удалить фон экспозиции или улучшить сотовые ясности.
- Нажмите на 2X2 бен или Живой бен получить картину, которая идеально подходит для видеосъемки
- Нажмите на кнопку "Макрос" в строке меню и выберите "писать в порт", выбрать порт "COM3", и "открыть". (Это открывает порт координировать свои действия с шприцевой насос.
- Внесите 1 мл клеточной суспензии KG1a в 5 мл пробирке вблизи линии трубы ввода, а затем место линейный вход трубы на дно пробирки.
- Переход к строке меню, нажмите на кнопку "Capture", "замедленная приобретения".
- Новое меню появится. Выберите протокол прочного 210 секунд, это длина программы для прокатки на HBMEC-60 ячейки. (Каждая фаза запрограммирован, чтобы сделать снимок каждую секунду в течение всего срока насос протокол. Он также настроен на отправку команды через порт COM3, чтобы начать насоса.) Если покадровой прерывается, насос не остановит сам по себе и должны быть сброшены. Нажмите Отмена, чтобы вернуться и жить изображения.
- Установить шприцевой насос, чтобы "режим программирования", согласно инструкции по эксплуатации. (Программа режим позволяет для ручного программирования специфических ставок потока (т.е. уровни напряжения сдвига), чтобы быть передана в камере и диктовать взаимодействия KG1a клетка за HBMEC-60 клеточный монослой.) Настройки KG1a ячейки прокатки на hBMEC Клетки были следующими 4,2 дин / см 2 в течение 45 с, 0,3 дин / см 2 в течение 60 с, а ступенчато увеличивается каждые 15 с до максимум 4,2 дин / см 2
- Стена напряжения сдвига (W-й) в камере рассчитывается по следующей формуле: W = й 6μQ / 2 б, где μ это расчетная вязкость среды (0,0076 P), Q является объемный расход в мл / с, это канал, высота (толщину прокладки) в см (0,03 см), и б это ширина канала в см (0,5 см). Расход регулировались с помощью программы режиме шприцевой насос.
- Микроскоп и компьютер готов к захвата замедленной киносъемки. Нажмите кнопку "начать работать" на компьютер, чтобы начать сбор данных. Во время работы программы, не забудьте добавить СМИ пробирку KG1a клетки для того, чтобы держать ввода / вывода трубки полного среднего (Убедитесь Есть нет воздушных пузырей).
5. Зависимость Sialylation терминала и поверхностного гликопротеина Е-селектина-опосредованной KG1a Сотовые 5. Холмистый рельеф (рис. 2; Видео Клипы 5.1-5.5)
- Опробование в KG1a ячейки прокатки на не стимулировали HBMEC-60 клеток. (Отрицательный контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над живое, без ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше.
- Опробование клеточных KG1a прокатки на HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β. (E-селектина зависимость контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше.
- Опробование клеточных KG1a прокатки на HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β, а затем нейтрализации анти-человеческий E-селектина Моава. (E-селектина зависимость контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить Ил- 1β-стимулированных HBMEC-60, предварительно обработанных нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава, как описано выше.
- Опробование в сиалидазы-переваренной KG1a ячейки прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60. KG1a клетки, предварительно обработанных 0.1U/ml холерный вибрион нейраминидазы для 1 час при 37 ° С были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше.
- Опробование протеазы-переваренной KG1a ячейки прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60. KG1a клетки, предварительно обработанных протеазы, 0.2U/ml Бромелайн за 1 час при 37 ° С, были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше.
6. Анализ NIS-Elements-Захваченные KG1a Графические элементы и клеточной KG1a Роллинг данных
- После временной последовательности приобретается, сохраните данные.
- Перейти в "меру" на вкладке меню и выберите пункт "определить порог". Перемещение баров, так что нужные ячейки окрашены в красный цвет. Выберите "все изображения", затем "Хорошо". Весь покадровой последовательности должны теперь быть изменены с помощью видимого красного подвижного клеток.
- К "Мера" и выберите "ограничения". (Ограничения позволяют пользователю исключить thresholded объектов, которые не представляют подвижного клеток. Это, прежде всего фона, созданного HBMEC-60 монослоя.) Выберите "площадь" и минимального входного и максимальные значения для области, для прокатки клеток. Повторите этот шаг для «удлинения» и «округлость».
- Выберите "мера" и выберите "создать двоичный использованием ограничений", и установить ограничение значений для оптимизации NIS-Elements система распознавания подвижного клеток на монослой HBMEC-60 клеток.
- Возвращаемся к "меры", выберите "поле данных", а затем выберите "перезагрузки данных". Закрыть меню.
- Вернуться в "Мера" и ГПlect "сканирования поля".
- Открытые "Мера", "Полевые данные", выберите "номер или объектов", а затем выберите "все поля" и экспортировать данные в Microsoft Excel.
- Выберите "Очистить данные" для подготовки NIS-Elements ячейки приобретение для следующего сбора данных.
Результаты:
Рисунок 3. Плоского потока палатой анализа E-селектина-связывающей активности на клетках KG1a. KG1a клетках, обработанных сиалидазы или протеазы, были проанализированы для прокатки эффективность на монослоев HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β. Отрицательный контроль подвижного эксперименты были проведены на основе анализа KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β-стимулированных HBMEC -60 клеток или на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток, обработанных нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава (5D11). Частоты сотовый подвижного проводились в трех экземплярах и проанализированы с NIS-Elements программное обеспечение. (* Статистическая значимость, р <0,001)
В этом видео-отчет, мы предоставили визуальной информации о том, как анализировать лейкоцитов - эндотелиальных взаимодействий клеток в физиологических условиях сдвига стресс. В частности, мы проанализировали роль Е-селектина - E-селектина лигандов в посредничестве лейкоцитов привязывать и прокат, клей поведение необходимых для совершения вторичной более стабильной обязательных мероприятий на основе таких рецепторов, как интегрины и гиалуронана рецепторов. Использование плоского потока камера адаптирована для использования с инвертированным микроскопом, Гарвардский шприцевой насос, видеокамера и компьютер / клетка приобретение оборудования, мы провели эксперименты котором E-селектина лиганд + KG1a клетки были использованы в качестве наших лейкоцитов модели и hBMEC клеток (HBMEC- 60) стимулировали провоспалительных цитокинов IL-1β, были использованы как наш E-селектина + человеческих эндотелиальных модели клетки (1-6). Как сообщалось ранее, мы наблюдали надежная клетка KG1a прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток в диапазоне сдвига уровня напряжения в E-селектина-зависимым образом (рис. 3) (Статистически значимых различий по сравнению с KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β стимулировали HBMEC-60 клеток). Отрицательный контроль, который состоял из KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток или на ИЛ-1β-стимулированных HBEMC-60 клеток, предварительно обработанных анти-человеческий E-селектина МАБ, проводились параллельно, чтобы продемонстрировать зависимость стимуляции цитокинов и E-селектина выражение для прокатки активности (рис. 3). Кроме того, прокат анализа клеток, предварительно обработанных KG1a холерный вибрион нейраминидазы (сиалидазы) или с бромелайн, неспецифические протеазы известно для переваривания поверхности Е-селектина гликопротеинов лиганд, подчеркнул важность терминал остатков сиаловой кислоты и поверхностных гликопротеинов для E-селектина лиганд деятельности (2,3).
Discussion
Параллельные пластины проточную камеру анализа, специализирующаяся на анализе системы пробирке использованы для изучения лейкоцитов - эндотелиальных взаимодействий клея при сдвиге условиях стресса аналогичных тем, передал на поверхности после капиллярной венулы. Как показано здесь, в нашей визуальной презентации, мы демонстрируем ценность этой системы для исследования роли Е-селектина - E-селектина лигандов в посредничестве лейкоцитов привязывать и катались по поверхности активированного эндотелия капилляров. Мы также выявить применения протеаз, гликозидазы и блокирования антител лечения для выяснения роли Е-селектина и его лигандов в этой системе. Эти анализы высокой воспроизводимостью и помочь сформировать экспериментальную базу для изучения E-селектина - E-селектина лиганд функции в живом организме.
В дополнение к изучению клеточной адгезии с монослоев цитокина активированных клеток эндотелия капилляров (hBMEC или человеческой вену пуповины или кожных капилляров эндотелиальных клеток), тесты могут быть выполнены с использованием очищенного рекомбинантного человеческого E-селектина или E-селектина-Ig химерные молекулы в качестве субстрата для клеточной адгезии. Другие взаимодействия клея опосредовано лейкоцитов (L-)-селектина и тромбоцитов (Р)-селектина могут быть проанализированы с использованием параллельных пластин проточную камеру технологии. Изменяя тип клеток монослоя / белок субстрат или лейкоцитов ввода / селектина-трансфектанта модели клетки, исследователи могут изучать роль этих взаимодействий в физиологических условиях напряжение сдвига.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия информации.
Acknowledgments
Финансирование этого проекта была предоставлена American Cancer Society исследований ученый премии (06-024-01-CSM, чтобы Чарльз Дж. Димитров), Национального института здоровья / Национальный институт рака грант (RO1CA118124 Чарльз Дж. Димитров), а также Национальных Институтов Здоровья / Национального института артритов и костно-мышечной и кожных заболеваний гранта (P30 AR042689 доктора Томаса С. Kupper; больницы Brigham и женщин, Бостон, Массачусетс).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).