Summary
Bu rapor, görsel bir tasviri lökosit leşimlerini kayma fizyolojik stres altında çalışmak için paralel plaka akış segment analizi sağlar. Bu yöntem, tetik lökosit endotel hücre yüzeyleri üzerinde yuvarlanan E-selektin, endotel (E)-selektin ve lökosit ligandlar rolünü araştırmak için özellikle yararlıdır.
Abstract
E-selektin, lökosit kutanöz, kemik ve iltihaplı dokulara dolaşan işe başlatmak yardımcı mikrovasküler endotel hücreleri üzerinde bir tip-1 membran protein. E-selektin ekspresyonu, deri ve kemik mikrodamarlar kurucu ve iltihaplı dokularda / IL-1α ve TNF-α, mikrodamarlar gibi pro-inflamatuar sitokinler, indüklenebilir. Bu lektin reseptör aracılık, karakteristik bir haddeleme davranış sonucu dolaşan lökositlerin, karbonhidrat karşı reseptör ligandlar ile zayıf bağlayıcı etkileşimleri. Çünkü bu etkileşimlerin daha istikrarlı bir yapışkan olaylar ve diapedesis aktivite, lökosit yuvarlanma faaliyet karakterizasyonu ve E-selektin, lökosit ligand belirlenmesi öncesinde, lökosit kaçakçılığı ve inflamasyon çalışmaları ve anti-inflamatuar terapötikler geliştirme (1-5) büyük hedefler var . Bu raporun amacı, E-selektin, E-selektin ligand etkileşimleri fizyolojik kan akışını koşullar altında çalışmak için en yaygın olarak kullanılan teknoloji görsel, kapsamlı bir tanım vermektir. Harvard Cilt Hastalıkları Araştırma Merkezi ile birlikte laboratuar dijital görselleştirme ve yeni kayıt yazılımı, NIS-Elements eşliğinde bir devlet-the-art paralel plaka akış odasına aparat kullanır. Bu teknoloji gerçek zamanlı olarak ekranda görselleştirme yanı sıra bir video formatında kayıt haddeleme aktivite için yapışma olayları analiz etmek için izin verir. Frekans, kayma direnci haddeleme ve bağlayıcı / tethering verimliliği gibi hücre adezyon parametreleri, bir Excel elektronik tablo ihraç ve istatistiksel analize tabi, NIS-Elements yazılımı ile hesaplanır. Burada sunulan gösteri, paralel plaka akış odası, canlı, insan kemik iliği endotel hücreleri (hBMEC) bağımlı E-selektin, lökosit yuvarlanma faaliyet araştırmak için kullandı. Ölümsüzleştirdi hBMEC hücre hattı HBMEC-60 hücreleri, endotel hücre modeli (6) olarak kullanılır iken, E-selektin ligand yüksek düzeyde bir ifade hematopoetik progenitör İnsan KG1a hücreler, bizim lökosit model olarak kullanılmıştır. Akış odasında, doğal E-selektin ekspresyonu neden ve simüle HBMEC-60 hücrelerinde IL-1 ile aktive edildi. Bizim video sunumu paralel plaka akış analizi proteaz veya glycosidase uygulamak suretiyle tespit edilebilir akış odasında fizyolojik E-selektin aracılı lökosit yuvarlanma faaliyetleri ve lökosit E-selektin ligand (lar) bu fonksiyonel karakterizasyonu eğitimi için uygun bir yöntem gösterdi sindirimler.
Protocol
1. Akış Odası Petriler hBMEC Hazırlama (HBMEC-60 Hücreli) Monolayer
- Kat 35 37 4 geceleme 20μg/ml fibronektin 2ml (PBS) ° C veya 3 saat x 10mm doku kültürü yemekleri ° C.
- Yemeklerinden fibronektin çözüm aspire edin ve [1,5 x10 5 HBMEC-60 hücre eklemek Hepes & Glutamin, Orta 199% 10 FBS,% 10 İnsan Serum, 5 adet / ml heparin, 1ng/ml rekombinant insan fibroblast büyüme faktörü,% 1 penisilin Streptomisin] çanağı ve onları>% 90 izdiham büyümeye izin. (2 gün sürer)
- Büyüme ortamı aspire ve E-selektin ekspresyonu up-regüle, 4-6 saat için 50ng/mL IL-1β ile taze orta ekleyin. Hücre mono tabakaları artık tahlil haddeleme için hazır. E-selektin fonksiyonunu engellemek için anti-insan E-selektin Moab (klon BBIG-E4 (5D11)) 37 ~ 1hr 20μg/ml eklenebilir ° C. nötralize
2. Akış Odası İnsan Hematopoetik Progenitör KG1a Hücreler hazırlanması
- İnsan hematopoetik progenitör KG1a hücreleri glutamin RPMI-1640 (1x10 6 hücre / ml) confluency büyüdü ve% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin ve akış odasına tayininde kullanılmak üzere şişesi doğrudan pipetlenir.
- Hücre sayısı hemasitometre ve sonra da hücre 1 x 10 6 hücre / ml 10mM Hepes (H / H Tampon) ve 2mm CaCl 2 HBSS yeniden askıya alınır kullanılarak hesaplanır.
- Hücreler tayininde kullanımı kadar buz üzerinde saklanır.
3. Mikroskop, Paralel Plakalı Akış Odası ve Şırınga Pompa (Şekil 1) hazırlanması
Şekil 1. Paralel Plakalı Akış Odası Analizi İllüstrasyon. Etkin ve tekrarlanabilir hücre analizi için en uygun düzenleme, inverted mikroskop, Harvard Şırınga Pompa, bilgisayar / kamera ve plaka paralel akış odasına yerleştirilir.
- Şırınga Pompa inverted mikroskop ve güç, güç ve ışık kaynağı açma ve mikroskop 10X Amaç seçin.
- 50ml konik tüp tutucuya yerleştirin ve H / H ve 2mm CaCl 2 ile doldurun.
- 50ml konik tüp altında test tüpü sahibi Yeri 5ml plastik test tüpleri
- (Şırınganın pistonu ve vücut hem de güvenli olduğundan emin olun) Şırınga Pompa şırınga 60ml yerleştirin.
- Stop-horoz 60ml şırınga sonu ve 3-way stop-horoz 5 ml'lik şırınga takmak için 3-yollu takın.
- Giriş tüp, sağ arka sol ve vakum tüpü çıkış tüpü ile mikroskop sahnede Yeri Paralel Akış Odası cihazları (GlycoTech, Inc.)
- Paralel plakalı cihazları sahneye uygun izin vakum tüp vakum ve açık hava valfi takın. Hava valfi (testine akışını odasının vakum etek hava geçirmez ise) kapatın.
- Çıkış boru hattı (soldaki mikroskop), 3-way stop-horoz takın. Aparat HBMEC-60 tek tabaka plaka yerleştirmek için hazırlanmıştır.
- Mikroskop merkezi yerleştirin HBMEC-60 tek tabaka levha ve yeri.
- Vakum ve pozisyonu tek tabaka levha merkezinde olduğu gibi plaka üzerinde akış odasına aparatı açın.
- HBMEC-60 tek tabaka levha üzerine hafifçe akışını odası aparatı alt ve akış odasına aparat aşağı emme izin. (Hava kaçan hiçbir sesler ve bu noktada kauçuk conta sıkıştırmak için odasına basınç uygulamak gerekebilir.)
- Vakum yeri giriş tüp 2mm CaCl 2 ile H / H içeren 50ml konik tüp içine (sağda) kurulmuş oldu.
- Açık 3-way stop-horoz 60ml yer enjektör ve pompa akmasına izin verecek şekilde "pompa modu."
- Giriş / çıkış hatlarını hava plaka üzerinde hücrelerin kaldırmadan kaldırmak için, sıvı aparatı ulaşmadan hemen önce mL / dakika sonra hızlı bir şekilde 0.5 'e ayarlanmış, Şırınga Pompa emme tüpü doldurmak için 2mL/minute kullanabilirsiniz. Bu özenle kurmak ve plaka tek tabaka kaldırma hava kabarcıkları önlemek başbakan zorunludur.
- 60ml şırınga, akış odası ve Şırınga Pompa içine sıvı hareket görülür sonra astar ve Akış odasının kullanıma hazırdır. Bu set, her hücre giriş çalıştırmak için gereken her yeni plaka için tekrarlanır.
4. Lökosit Rolling Olaylar NIS Elements kullanarak yakalama
- Masaüstünde açık NIS elemanları.
- Basın canlı görüntü simgesi "oyun". Otomatik pozlama şimdi plaka daha kolay görmek için izin verir ve odaklama için önemlidir.
- Mikroskop hücre tek tabaka düzgün odaklı olduğunu emin olun.
- 1 kare / saniye ve ayarlamak ışık mikroskop odaklı sonra, yeniden ayarlamak maruz kalma. Görüntü bilgisayarda görünür ve artık görülebilir düşük ışık seviyesi nedeniyle mikroskop vizör gerekir. Işık histogram sonra reklam olabilirarka plan maruz kaldırmak veya hücre netliğini artırmak için justed.
- Film çekimi için ideal bir görüntü elde etmek 2X2 bin veya Canlı Bin tıklayın
- Menü çubuğunda "Makro" tıklayın ve "Limana yazmak" seçeneğini seçin port "COM3" ve "açık". (Bu liman Şırınga Pompa ile koordine etmek için açılır.
- Pipet KG1a hücre süspansiyonu giriş boru hattı yakınında 5ml test tüpüne 1 ml ve daha sonra giriş boru hattı test tüpünün dibine yerleştirin.
- Menü çubuğu, "Yakala", "time-lapse edinimi."
- Yeni bir menü açılır. Protokol süren 210 saniye seçin, bu HBMEC-60 Hücreler üzerinde yuvarlanan programın uzunluğu. (Her bir aşama, pompa protokol süresi boyunca her saniye bir resim çekmek için programlanmıştır. Ayrıca, pompa başlatmak için COM3 bağlantı noktası üzerinden bir komut göndermek için ayarlanır.) Zaman atlamalı kesintiye uğrarsa, pompa durmayacak kendi başına ve sıfırlanması gerekir. Canlı görüntü dönmek için İptal tuşuna basın.
- Kılavuzuna göre "Program Modu" Şırınga Pompa Seti. (Program modu, özel akış oranları (yani kayma stres düzeyleri) odanın içinde aktarılırdı ve HBMEC-60 hücre tek tabaka üzerinde KG1a hücre etkileşimleri dikte manuel programlama için sağlar.) HBMEC Hücreler üzerinde yuvarlanan KG1a hücre ayarları 4.2 dynes 45 s / cm 2, 0.3 dynes 60 sn / cm 2 ve kademeli artışlar her 15 sn maksimum 4.2 dynes / cm 2
- Odasında duvar kayma gerilmesi (W st) aşağıdaki denkleme göre hesaplanır: G st / ml hacimsel debisi Q μ medyanın tahmini viskozite (0,0076 P) = 6μQ / 2 b, s, kanal cm yüksekliği (conta kalınlığı) (0,03 cm), ve b cm (0.5 cm) kanal genişliği. Akış hızları, Şırınga Pompa program modunu kullanarak düzenlenmiştir.
- Mikroskop ve bilgisayar artık zaman atlamalı fotoğraf çekmek için hazır. Basın bilgisayarda veri elde başlamak için "run start". Program çalışırken, KG1a hücreleri içeren test tüpü (hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun) giriş / çıkış boru tam orta tutmak için ortam eklemek için emin olun.
5. Terminal Sialylation ve E-selektin aracılığı ile KG1a Hücre 5 için Yüzey Glikoprotein Bağımlılığı. (5,1-5,5, Video Klipler Şekil 2) Rolling
- KG1a hücre üzerinde yuvarlanan bir Assaying olmayan uyarılmış HBMEC-60 hücreleri (Negatif kontrol) KG1a hücreleri hazırlanan ve üzerinde akış odasına infüze edildi canlı olmayan IL-1β-uyarılmış HBMEC-60, yukarıda açıklandığı gibi .
- HBMEC-60 hücreleri IL-1β ile önceden tedavi üzerinde yuvarlanan KG1a hücre Assaying KG1a hücreleri (E-selektin bağımlılık kontrolü) akış odasına üzerine hazırlanan ve infüze edildi canlı IL-1β uyarılmış yukarıda açıklandığı gibi HBMEC-60.
- IL-1β ve sonra nötralizan anti-insan E-selektin Moab (E-selektin bağımlılık kontrolü) KG1a hücreleri canlı üzerinden akış odasına hazırlanan ve infüze edildi IL-ön-tedavi HBMEC-60 hücreleri üzerinde yuvarlanan KG1a hücre Assaying Yukarıda açıklandığı gibi, anti-insan E-selektin Moab nötralize 1β-uyarılmış HBMEC-60 ön işlem.
- IL-1β-uyarılmış HBMEC-60 haddeleme sialidase sindirilir KG1a hücre Assaying. 37 1hr için nöraminidaz 0.1U/ml Vibrio Cholerae ° C ile ön tedavi KG1a hücreleri akış odasına üzerine hazırlanan ve infüze edildi canlı IL-1β-uyarılmış yukarıda açıklandığı gibi HBMEC-60.
- IL-1β-uyarılmış HBMEC-60 haddeleme proteaz sindirilir KG1a hücre Assaying. Proteaz ön işlem KG1a hücreleri, 37 1hr için 0.2U/ml Bromelain ° C, akış odasına üzerine hazırlanan ve infüze edildi canlı IL-1β ile uyarılmış, yukarıda açıklandığı gibi HBMEC-60.
6. NIS-Elemanları-Yakalanan KG1a KG1a Hücre Hücreler ve Grafikleme Rolling Veri Analizi
- Zaman dizisi elde edildikten sonra, verileri kaydetmek.
- Menü çubuğunda "ölçü" sekmesine gidin ve "eşik değerini tanımlamalıyız." Böylece istenilen hücrelerin kırmızı renkli barlar taşıyın. "Tüm görüntüleri" sonra "Tamam" seçeneğini seçin. Tüm zaman atlamalı sırası görünür kırmızı haddeleme hücreleri ile modifiye edilmelidir.
- "Tedbir" ve seçmek için git "kısıtlamalar." (Kullanıcı haddeleme hücreleri temsil etmemektedir eşiklenir nesneler dışlamak için izin Kısıtlamalar Bu öncelikle HBMEC-60 monolayer tarafından oluşturulan arka plan) "alan" ve haddeleme hücreleri için alan için giriş minimum ve maksimum değerler seçin. "Dairesellik" uzama "için bu adımı yineleyin."
- "Tedbir" i seçin ve "kısıtlamalar kullanarak ikili oluşturmak" seçeneğini seçin ve haddeleme hücreleri NIS-Elements yazılımı tanıma HBMEC-60 hücreleri, tek tabaka optimize etmek için kısıtlama değerleri ayarlamak.
- "Ölçmek", "Alan veri" seçin ve ardından, "reset veri" seçmek için geri dönün. Bu menüyü kapatın.
- "Ölçü" ve se dön"tarama alanı" bilirsiniz.
- Aç "Ölçü", "Alan data", "sayı veya Nesneler" seçin ve daha sonra "tüm alanlarda" seçin ve Microsoft Excel'e veri ihracat.
- Sonraki veri toplama için NIS-Elements cep satın hazırlamak için "açık veri" seçin.
Sonuçlar:
Şekil 3. Paralel Plakalı KG1a Hücreler E-selektin-Cilt Faaliyet Akış Odası Analizi. Sialidase veya proteaz ile tedavi KG1a hücreleri HBMEC-60 hücreleri IL-1β ile önceden tedavi mono tabakaları verimliliği haddeleme için analiz edildi. Negatif kontrolü haddeleme deneyler de KG1a hücreli olmayan IL-1β-uyarılmış HBMEC -60 hücreleri veya haddeleme analiz ederek yapılmıştır IL-1β uyarılan anti-insan E-selektin Moab (5D11) nötralize ile tedavi HBMEC-60 hücre. Hücre haddeleme frekansları üç nüsha olarak yapılan ve NIS-Elements yazılımı ile analiz edildi. (* İstatistiksel anlamlılık p <0,001)
Kayma fizyolojik stres koşulları altında endotel hücre etkileşimleri - video tabanlı olan bu raporda, lökosit analiz etmek için nasıl bir görsel tasviri. E-selektin, lökosit tethering aracılık ve haddeleme, integrinler ve hyaluronan reseptörleri gibi reseptörleri aracılığıyla ikincil daha istikrarlı bağlayıcı faaliyetlerinin taahhüt yapışkan bir davranış için gerekli ligandlar - Özellikle, E-selektin rolünü analiz. Ters bir mikroskop, Harvard Şırınga Pompa, video kamera ve bilgisayar / hücre satın alma donanım ile kullanmak için adapte paralel-plaka akış odasına kullanarak deneyler E-selektin ligand neyin yürütülen + KG1a hücreleri bizim lökosit modeli ve hBMEC hücreleri olarak olarak (HBMEC- 60), pro-inflamatuar sitokin IL-1β ile uyarılan E-selektin + insan endotel hücre modeli (1-6) olarak kullanılmıştır. Daha önce de bildirildiği gibi, biz sağlam KG1a hücre haddeleme gözlenen IL-1β-uyarılmış HBMEC-60, E-selektin-bağımlı bir şekilde (Şekil 3) (KG1a hücre haddeleme ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark kayma stres seviyeleri aralığında hücreleri IL-1β uyarılmış HBMEC-60 hücreleri). IL-1β-HBMEC-60 hücreleri uyarılır veya haddeleme KG1a hücre oluşan negatif kontrol, IL-1β uyarılan anti-insan E-selektin mAb ile HBEMC-60 hücreleri tedavi öncesi bağımlılığını göstermek için paralel olarak yapılmıştır yuvarlanma aktivite için sitokin uyarımı ve E-selektin ekspresyonu (Şekil 3). Vibrio cholerae ön işlem KG1a hücrelerinin Ayrıca, haddeleme analiz nöraminidaz (sialidase) veya bromelain, yüzey E-selektin glikoprotein ligand sindirerek bilinen bir non-spesifik proteaz, E-selektin ligand için terminal sialik asit artıkları ve yüzey glikoprotein önemini vurguladı aktivitesi (2,3).
Discussion
Paralel plakalı akış segment analizi lökosit eğitim için kullanılan in vitro test sisteminde özel bir benzer kayma gerilmesi koşulları altında endotel yapışkanlı etkileşimleri bir post-kapiller venule yüzeyinde aktarılmamaktadır. E-selektin, lökosit tethering aracılık ve aktif mikrovasküler endotel yüzey üzerinde yuvarlanan ligandlar - burada bizim görsel sunum tasvir, E-selektin rolünü araştırmak için bu sistemin değerini göstermek. Ayrıca, proteaz, glycosidase ve bu sistem içinde E-selektin ve ligandlar rol nedenlerine açıklık için engelleme antikor tedavileri uygulamanın ortaya koymaktadır. Bu analizler son derece tekrarlanabilir ve E-selektin eğitim için deneysel bir temelini oluşturan yardımcı in vivo olarak E-selektin ligand fonksiyonu.
Sitokin aktive mikrovasküler endotel hücreleri (hBMEC veya insan umbilikal ven veya dermal mikrovasküler endotel hücreleri) mono tabakaları ile hücre adezyon okuyan yanı sıra, yazı bir substrat olarak rekombinant E-selektin, insan ya da arıtılmış E-selektin-Ig kimerik molekülleri kullanılarak yapılabilir hücre adezyon. Diğer yapıştırıcı etkileşimleri aracılığıyla lökosit (P) (L)-selektin ve trombosit-selektin de paralel plakalı akış odasına teknolojisi kullanılarak test edilmelidir. Tip hücre tek tabaka / protein substrat değiştirerek ya da giriş lökosit / selektin transfectant hücre modelleri, araştırmacılar, fizyolojik kayma gerilmesi koşullar altında bu etkileşimlerin rolü eğitim görebilirsiniz.
Disclosures
Yazarlar, faiz veya açıklamalar herhangi bir çakışma var.
Acknowledgments
Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü hibe (Charles J. Dimitroff RO1CA118124) Ulusal Sağlık Enstitüleri; bir Amerikan Kanser Derneği Araştırmacı Ödülü, (Charles J. Dimitroff 06-024-01-CSM) tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır ve Sağlık / National Institute Artrit ve Kas-iskelet ve Cilt Hastalıkları hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri (P30 AR042689 Dr. Thomas S. Kupper, Brigham ve Kadın Hastanesi, Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178-500ML | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 0.5 M EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15575-038 | |
| 1M HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | |
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | |
| Fibronectin , from human plasma | Sigma-Aldrich | 86088-83-7 F2006-2MG | |
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | Sigma-Aldrich | I9401-5UG | |
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | |
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | |
| Heparin | Abraxis BioScience | 504011 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Plastic Test tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | |
| Bromelain | Sigma-Aldrich | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
