Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ、ルイサ ・ Ikner
表層土壌無機・有機粒子二次集合体を形成するために一緒に結合する異種混合物であります。内および凝集体間が空隙または視覚的に両方を含む毛穴空気や水します。これらの条件はすべて土に細菌、通常 100 万土のグラム当たりの広大な人口が含まれているので、細菌のための理想的な生態系を作成します。
細菌は原核生物と呼ばれる微生物の最も簡単です。この原核生物のグループ内で放線菌として知られている糸状微生物があります。放線菌は、細菌では実際が、よくフォーム菌糸に一緒にひもでつながれる複数のセルから成る糸状構造の為、細菌の分類内でユニークなグループであると考えられています。この実験は、希釈、めっき中に放線菌コロニーのため選択グリセロール ケース メディアを使用します。通常、放線菌、細菌の総人口の約 10% であります。細菌や放線菌が地球上のあらゆる環境であるが、これら土壌微生物の多様性と豊富な比類のないです。これらの微生物は、人間の生活に影響を与える人々 は何を食べる、飲む、呼吸、またはタッチも欠かせない。さらに、人々 に感染でき、病気を引き起こす細菌の種がある、癒しの人々 の自然な製品を作り出すことができる細菌があります。放線菌はストレプトマイシンなどの抗生物質を生産するため特に重要です。細菌は、栄養循環、植物成長の有機汚染物質の分解に重要です。
細菌は、生理と代謝多様なために土中では、一部で見つけることが種の数の面で非常に多様。細菌は、従属栄養、食品とエネルギーのためのブドウ糖などの有機化合物を利用する意味や栄養、食品とエネルギーのための硫黄などの無機化合物を利用する意味をすることができます。有酸素、呼吸のための酸素を利用することができます。 または嫌気性、酸素、硝酸や硫酸、レスピールするなどの形態を組み合わせて利用します。いくつかの細菌は酸素を使用することができます酸素の形態を組み合わせてや通性嫌気性菌として知られています。
Principles
土壌試料中の細菌の数を列挙する方法の 1 つは、希釈やめっき方法論を利用します。この方法論は、細菌の増殖、プロセスと呼ばれる、「培養技術」のための媒体として寒天を利用して土壌内で見つかった細菌の広大な数のため土壌の小さなサンプルは直列ペトリ プレート内の寒天にメッキされている前に、水で希釈しました。通常、少量の希釈土壌懸濁液の 0.1 を 1 mL に含まれている土は「広がる」寒天プレートの表面。プレートには、溶融時ホット、固体ですがクールである寒天が含まれています。寒天、に加えてペプトン酵母や R2A として市販製品などの栄養素は、従属栄養細菌の増殖は、中長期に追加されます。
希釈・ メッキは、土壌細菌の列挙体の安価な比較的簡単な技術です。しかし、手法にいくつかの欠点があります。いくつかの一般的なエラーと希釈とめっきの試金に関連付けられている前提条件は、次のとおり: 植民地を生じさせるすべての単一の土壌のバクテリアが、現実の植民地真人為的カウントの過小評価の結果、細胞の塊から発生する可能性と見なされます。土のシリアル希釈時に土壌粒子 (底に落下) を解決することはので、土壌の真の約数は次の希釈に渡されません。実行可能な多くの土壌微生物は、非培養可能です。合理的な時間枠 (1-2 週間) 内で目に見えるコロニーいない遅い成長する細菌があります。
また、嫌気性菌は、好気性の条件の下では成長しない、成長することは細菌の培地に添加栄養素によって対象として選択されます。したがって栄養硫黄酸化剤の硫黄を選択しながら、R2A は従属栄養細菌の選択します。全体的にみて、それはすべて土壌細菌の 0.1 を 1% だけを培養することができることが推定されます。したがって、希釈のめっき土壌細菌培養細菌のみアカウントし、1 ~ 2 桁の真の実行可能な土人口を過小評価します。土壌の希釈とめっきに起因する従属栄養細菌のコロニーの例は図 1に示します。肉眼に目に見えるようにするコロニーの約 100 万の細菌細胞が必要であるに注意してください。
この実験は、希釈や拡散めっき方法論の土壌サンプル中の細菌の数を列挙するために使用を示します。具体的には、2 つのメディアが使用される: すべての細菌や放線菌の選択したその他のもの。寒天版の細菌のコロニーが育てた、一度ストリーク プレート法による選択したコロニーの純粋培養を分離します。このような純粋培養し、さらに解析でき特定の特性や機能の特徴します。
図 1。R2寒天プレートに従属植民地します。多様な形態を持つ離散コロニーの数は、土壌から希釈とめっき後発生します。学術出版物によって与えられる使用するためのアクセス許可。
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Procedure
1. 土壌の希釈液の調製
- 手順を開始するには、土壌サンプルの 10 g を量り、95 mL の脱イオン水を加えます。よく、懸濁液を振るし、"A"としてラベルを付けます。
- 土が落ち着く前に滅菌ピペットで懸濁液の 1 mL を削除し、容量 9 mL の脱イオン水空白にそれを転送します。渦徹底的と"B"とラベル。
- この希釈手順 3 回、毎回前懸濁液 1 mL、9 mL の脱イオン水空。C、D、および E をチューブ、順番にこれらをラベルします。これは、結果 10-1 10-5グラムの 1 mL あたり土 ~ のシリアル希薄、
2 細菌培養用、拡散板
- 細菌のコロニーを成長し、C、D、および e. 渦のサンプル C として、D と E、および各プレート上に 0.1 mL のピペットなど 3 つの事前に用意されたペプトン酵母寒天とラベルを取る。これは 10 の要因によってさらに、希釈価値を高める (C 10-3D = 10-4E を = = 10-5)。
- 次に、ガラス スプレッダーをエタノールに浸し。数秒を発火させ、エタノールを燃焼火炎の拡散機を配置します。これは、スプレッダーを滅菌します。
- 炎が消滅するまでは、最初のプレートの上散布を保持します。蓋を閉じるを保持しているプレートを簡単に開けます。接種から寒天にスプレッダーをタッチ (接種文化を開始するために使用するセルの =) クール、そして自由液体の痕跡が消えるまで寒天の表面を菌のドロップを普及します。プレート蓋を取り付けます。
- 再炎の拡散機と次のプレートは、迅速に作業を繰り返して浮遊生物、寒天培地を汚染しないように
- 1 週間室温で細菌の版を孵化させなさい。寒天培地の表面に落下からの凝縮から水分の低下を防ぐために潜伏中にプレートが反転されていることを確認します。
放線菌のため 3. 拡散板
- 放線菌の成長、3 つの事前に用意されたグリセロール-カゼイン プレートを取ると前述のテクニックとして B、C、および D. を使用してそれらのラベル、拡散板 B、C、および D. 懸濁液から 0.1 mL放線菌は、通常細菌の人口の 1/10thとしているため、低い希釈 (B = 10-2C = 10-3D = 10-4)。
- 2 週間室温 (反転) 放線菌プレートを孵化させなさい。
4. 細菌や放線菌数
- インキュベーション後、慎重に、すべての細菌の版を調べるし、コロニーのサイズと形状の違いに注意してください。寒天上に成長した、細菌は無色透明からピンクや黄色、明るいオレンジ色に至るまでぬるぬるしたコロニーを生成します。対照的に、放線菌のコロニーは、しっかりした、革のようなされて、他の細菌のコロニーが中傷する圧力の下で入ります。これにより滅菌ループとの接触によって区別される植民地です。
- カウントし、放線菌を含む細菌のコロニーの数を記録します。プレート プレートごと 30 200 コロニーとカウントされます。
5. 純粋培養の分離
- 個々 の細菌のコロニーをプレートのいずれかから選択します。土に特に興味がある場合より多くの植民地を選択できます。それは、よく分離されている純粋な植民地を持っている傾向がある高希釈プレートを使用します。近隣植民地から十分に分離、互いから明瞭な形態学的に見えるコロニーだけを選択します。
- ループをアルコールに浸漬し、それを炎で滅菌します。すぐに、関心のペトリ皿を開き、それを冷却する寒天培地の裸地にループをタッチします。少量のループに関心の植民地を削除します。
- 連勝数センチを作る新鮮なペプトン酵母プレートを取って 1 つの側面に長い。消毒し、再度、クールな最初のパスでのみ初期の連勝を越える連勝をします。同様にさらに 2 回繰り返します。この光線「希釈」は、互いから分離されているループのセルに結果します。2 週間室温でインキュベートする暗い部分にプレートを配置します。
環境微生物の正確な数を決定するは、土壌生態系の健全性を評価することが重要です。これは、適切な希釈で細菌のコロニーを培養によって実現できます。
土壌細菌は、分解、窒素固定、養分循環役割を果たして健全な土壌生態系の重要な部分です。表層土壌の有機基板、空気または水で満たす、無機粒子が毛穴を取り巻く複雑なマトリックスを形成します。これらの条件は通常上向きに 1 グラムあたり 100 万の細菌を含む表層土壌の細菌のための理想的な生態系を作成します。
細菌のこの高濃度、希釈は成長媒体上にめっきする前に必要です。シリアルの希薄は初期の土壌サンプル中の細菌数の計算を可能にするメディア版で成長する単一コロニーのために十分に低いレベルに元の土壌サンプルの濃度を減らすことができます。
このビデオは、土壌サンプルのシリアル希薄を準備する方法、プレートにこれらの細菌のサンプル方法、土壌細菌希釈プレートからカウントを計算する方法を説明します。
細菌は、種や生態系の面で非常に多様の単純な原核生物です。放線菌は、彼らが一緒にフォーム菌糸に神経質成長頻繁の糸状の構造のためのユニークなグループである細菌のサブセットです。
通常、放線菌は土壌中総細菌の人口の 10% を占めます。細菌や放線菌は、地球上のほぼすべての環境で豊かなが、比類のない多様性と土壌の豊かさがあります。
列挙は土壌細菌と培養し、希釈めっきによって識別される可能性があります。ここでは、土壌サンプルは順次水で希釈し、寒天成長板に分散します。結果として得られるコロニーはカウントされます。希釈倍率とともに、この値を使用して、土壌中の細菌の初期濃度を明らかにします。
希釈メッキは一般的な安価な簡便な細菌の列挙が、それはいくつかの欠点に苦しみます。希釈は、偏った成長につながる可能性がありますに解決するため、土はできません。いくつか土壌細菌がない文化のプレート、または遅い成長観察します。また、このメソッドでは、コロニーは単一の細菌から形成されるが、彼らは複数の細胞の塊から発生する可能性を前提としています。
特定の細菌種は異なった成長媒体でよりよく育ちます。広い範囲のバクテリアを培養する一般的な基板は寒天ペプトン酵母鋼板です。放線菌は優先的にこれらの糸状性細菌の成長に合わせて、グリセロール-カゼイン基板で育ちます。
細菌列挙体の背後にある概念を理解する研究室では、このプロセスを実行する方法を見てみましょう。
手順を開始するには、土壌サンプルの 10 g を量り、95 mL の脱イオン水を加えます。よく、懸濁液を振るし、"A"としてラベルを付けます。土が落ち着く前に滅菌ピペットで懸濁液の 1 mL を削除し、9 mL の脱イオン水にそれを転送します。渦徹底的と"B"とラベル。
この希釈手順 3 回、毎回前の懸濁液の 1 mL、9 mL の脱イオン水。C、D、および E をチューブ、順番にこれらをラベルします。10-1 10-5グラムの 1 mL あたり土 ~ のシリアル希薄でこの結果します。
細菌のコロニーを成長するには、3 事前に用意されたペプトン酵母寒天を取ると対応するサンプルの C、D、および e. 渦としてそれらをラベルし、各プレート上に 0.1 mL をピペットします。1 mL あたり CFUs が報告されているのでさらに 0.1 mL を使用して 10 倍希釈を増加します。
次に、ガラス スプレッダーをエタノールに浸し。数秒を発火させ、エタノールを燃焼火炎の拡散機を配置します。これは、スプレッダーを滅菌します。
炎が消滅するまでは、最初のプレートの上散布を保持します。蓋を閉じるを保持しているプレートを簡単に開けます。クールに、接種から寒天にスプレッダーをタッチし、自由液体の痕跡が消えるまで、接種材料表面の周りのドロップを広めます。プレート蓋を取り付けます。
再炎の拡散機と次のプレートは、迅速に作業を繰り返してプレート浮遊生物を汚染しないようにします。水分低下、寒天の上に落下を防ぐために板を反転させるし、1 週間室温でプレートを孵化させなさい。
放線菌の成長、3 つの事前に用意されたグリセロール-カゼイン プレートを取ると前述のテクニックとして B、C、および D. を使用してそれらのラベル、拡散板 B、C、および D. 懸濁液から 0.1 mL放線菌は、通常 1 としているため、低い希釈/細菌の人口の第 10 回。
最後に、これらのプレートを反転、2 週間常温で保存します。
インキュベーション後、慎重に、すべての細菌の版を調べるし、コロニーのサイズと形状の違いに注意してください。寒天上に成長した、細菌は無色透明からピンクや黄色、明るいオレンジ色に至るまでぬるぬるしたコロニーを生成します。対照的に、放線菌のコロニーは、しっかりした、革のようなされて、他の細菌のコロニーが中傷する圧力の下で入ります。これにより滅菌ループとの接触によって区別される植民地です。
カウントし、放線菌を含む細菌のコロニーの数を記録します。プレート プレートごと 30 200 コロニーとカウントされます。
特定の個々 の細菌の文化を育てる、プレート、近隣のコロニーからはよく分かれているコロニーを選択のいずれかから離散コロニーを選択します。拡散ループを滅菌し、プレートを開き、空いている場所を冷却するためにループをタッチします。次に、ループに関心のコロニーの小さい量を選択します。
連勝数センチを作る新鮮なペプトン酵母プレートを取って 1 つの側面に長い。消毒し、再度、クールな最初のパスでのみ初期の連勝を越える連勝をします。同様にさらに 2 回繰り返します。この光線「希釈」は、互いから分離されているループのセルに結果します。2 週間室温でインキュベートする暗い部分にプレートを配置します。
細菌や放線菌のコロニー数から土壌 1 g コロニー形成単位を決定できます。土のグラムあたりのコロニー数コロニー メッキ希釈の逆数によって乗算プレートのカウント数と同じです。たとえば、10-5 0.1 mL 接種剤で希釈のプレートに、46 のコロニーがカウントされる場合土のグラム当たり CFU は 46、または土のグラム当たり 4600 万 CFUs 10-6と同じで。
細菌数および文化は、多くの科学的な調査またはプロトコルの重要な第一歩です。
健康な土が 10 間含まれています6と 1 グラム当たり 10 の8細菌。10 未満のカウントと関心の土壌の状態を判断する土壌細菌の列挙を使用できます6と 1 グラム当たり 10 の8細菌不健全なまたは悪い土を示します。不足栄養素や有機物、極端な pH や土壌汚染のための非生物的ストレスがある可能性があります。
今日の医学で使用される抗生物質の多くの種類は、土住居の細菌や真菌から識別された最初。土の文化からの純粋な系統を分離することができます潜在的科学者のヘルプのヘルプ新しい抗生物質化合物を特定します。ここでは、細菌をテストまたは関心の分離の化合物は、細菌の芝生の成長板に追加できると芝生の成長に及ぼす影響を記録しました。明確なパッチ テスト細菌や化合物の成長が抑制された細菌の芝生では、抗菌活性を可能性があります。
エンドウ豆および豆を含むマメ科植物は窒素固定共生関係に依存して細菌。これらの細菌は土壌や根系における結節内で自由に生きるし、工場で使用されている窒素化合物を作る。貧しい土壌では土壌から窒素固定菌の培養とマメ科の作物を補う成長と植物の健康が向上します。これは大きい作物の収量を得られる大きく、丈夫植物につながります。
ちょうど細菌列挙体にゼウスの導入を見た。今、プレートのコロニーを数えるとコロニーの分離の方法、土壌試料の希釈液を実行する方法および土壌試料中の細菌の数を計算する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
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Results
乾燥重量ベースで 20% の含水土壌 10 g サンプルは、メッキ技術と希釈による培養細菌を分析します。希釈は、表 1に示すように、行われました。1 mL の溶液 E 適切な媒体に注ぐメッキは、200 のバクテリアのコロニー。
しかし、湿った土の 10 g
そこで
| ステップ | 希釈 | |
| 土壌 10 g (重量/体積) | 95 mL 生理食塩水 (溶液) | 10-1 |
| 1 mL の溶液 (ボリューム/ボリューム) | 9 mL 生理食塩水 (溶液 B) | 10-2 |
| 1 mL の溶液 B (ボリューム) | 9 mL 生理食塩水 (溶液) | 10-3 |
| 1 mL の溶液 C (ボリューム) | 9 mL 生理食塩水 (溶液) | 10-4 |
| 1 mL の溶液 D (ボリューム) | 9 mL 生理食塩水 (溶液 E) | 10-5 |
表 1: 希釈し、試料のめっき。
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Applications and Summary
希釈の 2 つの基本的なアプリケーションと土壌細菌のめっきがあります。最初のアプリケーションは、特定の土壌内培養の細菌の列挙体です。土壌細菌の数の定量化は、土壌の健康の徴候を与えます。たとえば、10 がある6 108培養細菌土壌 1 g に存在する、これと思われる健全な数字。A 数 10 未満 1 グラムあたり6を示します; 低有機物の土壌の栄養素の不足が原因である可能性があります貧しい土壌の健康極端な土壌 pH 値によって課されたストレス耐性誘導機構 (pH < 5 または > 8);や毒性が有機又は無機の汚染物質によって課されます。
2 番目の主要なアプリケーションの可視化と細菌の純粋培養の分離であります。純粋培養は、特徴とし、医療や環境のアプリケーションに有用である可能性があります特定の特性のために評価します。例: 抗生物質の生産;有毒な有機物の分解または特定根粒菌豆や豆などのマメ科作物の窒素固定に便利。
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