Analyse d'ARN d'échantillons environnementaux à l'aide de la RT-PCR

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, permet la détection des virus à ARN et de l’expression génétique microbienne dans l’environnement.

Contrairement aux organismes cellulaires provenant des humains aux bactéries, qui utilisent l’ADN comme leur matériel génétique, certains virus ont des génomes d’ARN, y compris de nombreux virus pathogènes tels que la grippe, virus Ebola et le VIH. Tandis que certains virus peuvent être détectées en observant le phénotype pathogène qui se développe lorsqu’il est utilisé pour infecter les cellules en culture cellulaire, une majorité n’a aucune méthode de caractérisation basée sur l’élevage. RT-PCR permet de détecter la présence de ces virus dans l’environnement avec la sensibilité élevée.

Dans le même temps, les organismes avec des génomes de base d’ADN « expriment » l’information génétique codée dans les génomes de leur ADN par « transcription » dans messenger ou « m » ARN, qui peut alors être « traduit » protéines aux fonctions enzymatiques ou structurels dans les cellules. Comme les microbes répondent et s’adapter aux changements dans l’environnement en tournant ou désactiver diverses voies génétiques, RT-PCR peut servir à surveiller les changements dans l’expression des gènes pour servir d’éventuels assesseurs écosystème.

Cette vidéo va sur les principes qui sous-tendent la RT-PCR, décrire une procédure généralisée pour effectuer cette technique et enfin, examiner quelques-unes des façons que cette méthode est appliquée aujourd'hui en microbiologie environnementale.

Il y a deux parties essentielles à cette procédure : l’extraction d’ARN à partir d’échantillons biologiques, suivie de sa transcription inverse dans l’ADN.

L’isolement du RNA consiste à lyser les cellules de l’échantillon en ajoutant un détergent qui décompose les lipides et les protéines, suivies de la rupture mécanique. Extraction de RNA de virus habituellement nécessite l’ajout des protéases, qui sont des protéines-digestion enzymes, pour briser les capsides le virus - les manteaux de protéine dure qui forment la particule virale. En revanche, lors de l’obtention RNA des organismes multicellulaires, le lysat peut doivent être traités avec des enzymes capables de dégrader l’ADN, ou DNAases, pour éviter des résultats en aval étant confondus par la présence de l’ADN chimiquement semblable.

RNA peut ensuite être purifié des lysats de deux manières. Dans une méthode, dite d’extraction de guanidinium acide de thiocyanate-phénol-chloroforme, le lysat est mélangé avec un mélange aqueux-organique qui est ensuite centrifugé pour séparer les phases. Les protéines seront être partitionnées dans la phase organique, débris de cellules lysées dans l’interphase nuageux et d’acides nucléiques dans la phase aqueuse. La phase aqueuse supérieure peut ensuite être collectée et RNA est précipité par l’addition d’alcool comme l’isopropanol, ce qui diminue la solubilité de l’acide nucléique dans l’eau.

Dans ARN basée sur les colonnes, le lysat est mélangé à l’alcool et ensuite passé à travers une colonne de gel filtration avec une résine chargée négativement, comme la silice. Le lysat est prêt pour que les ions chargés positivement sous la forme de tampon « ponts salins » qui permettent à la colonne vertébrale de phosphate chargé négativement des acides nucléiques pour lier à la résine. Tous les autres contaminants sont alors emportées. Les acides nucléiques sont « élués » de la colonne à l’aide d’un tampon de faible teneur en sel ou d’eau. ARN simple brin ayant moins de charges négatives que l’ADN double brin, il peut être préférentiellement éluée à l’aide de tampons de concentrations spécifiques.

Une fois isolés, l’ARN se transforme l’ADN plus chimiquement stable. Les scientifiques ont exploité une enzyme naturellement codée par des rétrovirus comme le VIH. Cette enzyme est connue comme la transcriptase inverse, ou « RT ».

RT synthétise l’ADN complémentaire ou « c » d’un court tronçon de nucléotides connue comme une amorce. Cette amorce peut avoir différentes séquences, selon le but de l’expérience. Par exemple, l’apprêt peut être conçu pour avoir une séquence spécifique, afin de détecter les gènes spécifiques ou des organismes. Une fois synthétisées, cet ADNc « premier volet » peut être amplifié par PCR ordinaire.

Maintenant que nous avons une compréhension des principes derrière la RT-PCR, nous allons étudier un protocole pour effectuer cette technique sur des échantillons d’ARN prélevés dans l’environnement.

Pour commencer la procédure, trouver un emplacement de collection d’échantillon en utilisant les coordonnées GPS ou la vue. Choisissez des points aléatoires au sein d’une région pour obtenir un aperçu général des habitats microbiens.

Recueillir l’échantillon solide, pousser et tourner une tarière à main dans le sol à la profondeur prédéterminée. En soulevant la tarière, sol se trouvent dans la tige creuse de la tarière.

Ce sol est gratté directement dans un sac de collection du sol et le sac est étiqueté avec le lieu, nom, date, temps de collecte et de toute autre information nécessaire.

Transférer le sol au laboratoire et passez le sol à travers un tamis de 2 mm pour enlever le gravier et la roche. Analyser un échantillon du sol pour la teneur en eau, qui peut être instructive quant au niveau de l’activité microbienne dans le sol. Pour ce faire, consulter vidéo « détermination de l’humidité contenu du sol » de cette collection.

Pour le prélèvement d’échantillons de l’eau, choisir un site d’intérêt similaire à la collection de sol et recueillir de l’eau dans un flacon stérile en plastique à parois épaisses. Prendre note du volume d’eau recueilli. Test de l’eau immédiatement pour les paramètres comme la température, du pH et salinité, qui peut fournir des informations importantes concernant les niveaux microbiens prévus dans l’échantillon. Ensuite, placez la bouteille dans le refroidisseur et le transfert au laboratoire.

Micro-organismes tels que les virus sont collectés et concentrés à partir de l’échantillon environnemental.

RNA peut être extraites des virus prélevés par la méthode de colonne de spin à l’aide de kits commerciaux de RNA extraction conformément aux instructions du fabricant. Tampon de lyse, complété avec de l’éthanol, est d’abord mélangée avec l’échantillon. Placer le nombre approprié de colonnes de spin dans les tubes de prélèvement, puis appliquez les échantillons sur la matrice colonne. Centrifuger les colonnes à environ 12 000 x g pendant 1-2 min laisser les acides nucléiques lier à la colonne et jeter le liquide accréditives.

Tampon de lavage s’ajoute les colonnes et centrifuger à nouveau. Placer les colonnes dans des microtubes nouvelle, stérile 1,5 mL faible adhérence. Ensuite, ajoutez de l’eau qui est libre de ribonucléases, qui sont des enzymes qui dégradent les ARN, aux colonnes et centrifuger pendant 30 s pour Éluer la RNA. L’ARN éluée peut être conservée à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

Avant l’expérience, des amorces appropriées devraient être conçues pour détecter les séquences d’intérêt, qui peuvent servir de marqueurs pour la présence de microorganismes spécifiques.

Sortez les réactifs de RT conservés à-20 ° C et décongeler les réactifs congelés sur la glace (ou à température ambiante). Il s’agit de nucléotides, tampon de transcription inverse et amorces. Une fois décongelé, garder les réactifs sur la glace ; l’enzyme transcriptase inverse et inhibiteur de RNase doivent toujours être bien sur la glace.

Alors que les réactifs sont en fonte, calculer les volumes et les concentrations des composantes de la réaction. Une fois que les réactifs sont décongelés, doucement vortex et un essorage chaque tube pour s’assurer que le contenu sont bien mélangés.

Travaillant dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination, assembler les composants d’un mélange maître à ajouter dans chaque tube PCR. Lors de l’assemblage master mix dans un tube Eppendorf, veillez à modifier les pointes de pipette entre chaque réactif pour éviter la contamination. Après que tous les réactifs ont été ajoutés au tube Eppendorf, vortex et la Centrifuger le capitaine mélangent doucement le tube pour assurer un mélange homogène.

Étiqueter un ensemble de tubes PCR, en veillant à inclure les contrôles. Aliquote un volume égal de master mix dans chaque tube. Ensuite, ajouter des composants de réaction spécifiques, tels que les extraits de RNA ou eau pour contrôle négatif.

Une fois que tous les composants sont ajoutés, placer les tubes dans un thermocycleur et définir le programme de transcription inverse d’exécuter. L’ADNc peut alors être soumis à l’amplification par PCR. Pour une description détaillée de cette étape, reportez-vous à la vidéo de cette collection sur la PCR.

Lors de la PCR est terminée, certains des produits PCR peuvent être séparés et visualisés sur gel d’agarose. Par exemple, une amorce de gène-spécifique a été utilisée ici pour détecter la présence d’un virus à ARN. Bandes de la taille attendue sont obtenus par la réaction de RT-PCR, mais pas des contrôles négatifs, indiquant la présence de ce virus dans l’échantillon testé.

L’identification des micro-organismes base d’ARN par RT-PCR permet l’analyse de la santé écologique, des risques pour l’environnement et la conservation de la biodiversité.

L’utilisation de micro-organismes pour nettoyer des hydrocarbures et de solvants de l’eau et des sols pollués représente une alternative de remédiation Écodurables. Compréhension de l’expression génétique microbienne indigène peut mettre en évidence les voies microbiennes spécifiques qui décomposent les contaminants dans ces conditions. RT-PCR est souvent utilisée pour amplifier l’ADN messagère de ces échantillons environnementaux.

Mesures de santé publique exigent souvent une surveillance rapide des sources virales de l’infection dans l’environnement. La grippe aviaire, par exemple, est très contagieuse et peut se propager rapidement à la volaille, le bétail et même des humains. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié la menace de la grippe aviaire, propagé par les oiseaux sauvages.

En utilisant une configuration portable de RT-PCR et l’appareil, ils ont projeté un éventail d’oiseaux sauvages, même dans des régions éloignées, à déceler rapidement les infections et prévenir la transmission.

Enfin, RT-PCR peut servir à caractériser « biopesticides » en cours d’élaboration pour nuisibles telles que le tireur d’élite à ailes vitreux, Homalodisca vitripennis, l’hôte pour une maladie qui endommage gravement les vignes en Amérique du Nord. Un roman simple brin-virus à ARN est développé comme un agent pour infecter de cet insecte. En utilisant une combinaison de culture cellulaire Homalodisca et confirmation de RT-PCR de la charge virale, ces auteurs ont réussi à propager une forte concentration de virus pour utilisation comme agent de lutte biologique.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour Analyzing RNA-Based les organismes environnementaux par RT-PCR. Vous devez maintenant comprendre la théorie derrière le protocole, comment appliquer la technique à vos recherches et certaines des manières dont il est utilisé dans le domaine aujourd'hui. Merci de regarder !