Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz
Reacción en cadena reversa de la transcripción-polimerasa (RT-PCR) implica el mismo proceso que la PCR convencional — temperatura ciclismo para amplificar ácidos nucleicos. Sin embargo, mientras que la PCR convencional sólo amplifica los ácidos desoxirribonucleico (ADN), RT-PCR permite la amplificación de los ácidos ribonucleicos (RNA) mediante la formación de ADN complementario (cDNA). Esto permite que organismos basados en RNA dentro del entorno para ser analizados utilizando métodos y tecnologías que están diseñados para el ADN.
Muchos de los virus encontrados en el ambiente usan RNA como su material genético. Varias basadas en RNA patógenos virales, como el Norovirusy organismos indicadores, tales como virus de moteado suave del pimiento (PMMoV), no tienen métodos de detección basados en la cultura para la cuantificación. Para detectar la presencia de estos virus de RNA en muestras ambientales de suelo, agua, agricultura, etc., ensayos moleculares dependen de RT-PCR para convertir el RNA en DNA. Sin RT-PCR, microbiólogos no sería capaces de análisis y de investigación de numerosos virus RNA-basado que plantean riesgos para la salud humana y ambiental.
RT-PCR se puede también emplear como una herramienta para medir la actividad microbiana en el medio ambiente. ARN mensajero (ARNm) es la sola plantilla para la traducción de la proteína, y medición de los niveles de los mRNAs diferentes indica que genes que microbios se expresan en el entorno. Análisis de expresión génica da pistas de qué vías biológicas son utilizadas por los organismos para sobrevivir en diferentes condiciones ambientales. En algunos casos, la expresión génica puede ser utilizada para determinar que organismos pueden sobrevivir mejores en duras condiciones y tienen las capacidades para la biorremediación de suelos contaminados o de agua.
Principles
PCR se basa en la amplificación de plantillas de la DNA, que limita su uso en la detección de RNA de organismos. Sin embargo, RT-PCR proporciona un medio para que el uso de RNA para producir cDNA utilizando enzimas especializadas, conocidas como transcriptasa inversa (RT). Este cDNA puede utilizarse entonces como la plantilla de partida para la posterior amplificación con PCR convencional (figura 1).
Reversa de la transcripción puede ser controlada amplificar sólo productos o una comunidad entera de los ácidos nucleicos en una muestra ambiental, dependiendo de los iniciadores que son utilizados a plantilla de la síntesis de cDNA. Esto es importante, como muestras de suelo y agua son a menudo saturadas con varios ácidos nucleicos que no desea para análisis específicos. Cartillas al azar, que pueden atar a las secuencias de RNA encontradas en cualquier tipo de microbios, pueden utilizarse en RT-PCR para detectar ARN más, por lo que la muestra puede ser analizada para la presencia y abundancia relativa de varios organismos en el medio ambiente. Por otro lado, primers específicos de secuencia inician la síntesis de cDNA para secuencias precisas se encuentran en sólo uno o unos pocos organismos. Esto permite una muestra ambiental a probarse para un propósito específico, tales como determinar si Norovirus, que pueden causar enfermedades gastrointestinales en humanos, está presente en el agua.
Figura 1. Proceso paso a paso del análisis de RT-PCR de muestras ambientales de RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. muestra Colección: Muestra de suelo
- Encuentre una muestra ubicación vía GPS, coordenadas o vista.
- Para el muestreo al azar, escoger puntos al azar dentro de un área para obtener un censo general de los hábitats microbianos. Recoge muestras de puntos a lo largo de una línea recta, por ejemplo, junto a un cauce de transectos. Muestras de cuadrícula se toman sistemáticamente de puntos a intervalos regulares y son útiles para las comunidades microbianas de la cartografía en una zona desconocida o variable.
- De muestreo dentro de un 3-6 pulgadas (7.5-15 cm) profundidad proporciona acceso a la actividad microbiana más abundante que está cerca, pero no dentro de la rizosfera (región estrecha de suelo afectado directamente por las raíces de la planta y sus microorganismos asociados).
- Para recolectar la muestra de suelo, empuje y gire un taladro de mano en el suelo a la profundidad predeterminada.
- Levantar la barrena. El suelo se encuentra dentro del tallo hueco de la barrena.
- Raspar el suelo en la parte inferior de la barrena en una bolsa de recolección de suelo. Asegúrese de no tocar o contaminar el suelo.
- Etiquetar la bolsa con ubicación, nombre, fecha y hora.
- En el laboratorio, pasa del suelo a través de un tamiz de 2 mm para eliminar cualquier grava y roca.
- Analizar una porción del suelo para contenido de humedad del suelo. Para más detalles de este paso, consulte JoVE Ciencias de la educación video sobre humedad del suelo.
2. muestra Colección: Muestra de agua
- Encontrar la ubicación de la muestra vía GPS, coordenadas o vista.
- Recoger el agua en una botella de almacenamiento. Registrar el volumen de agua recolectada; Si los microbios en la muestra se analizan cuantitativamente, entonces la concentración microbiana se puede determinar basándose en el volumen recogido.
- Inmediatamente probar el agua para los parámetros requeridos para el experimento (temperatura, pH, conductividad, salinidad, nitrógeno y fósforo contenido, etc.) utilizando las sondas electrónicas adecuadas.
- Coloque la botella que contiene la muestra de agua en una hielera con hielo. Transferencia de la hielera al laboratorio.
3. extracción de RNA
- Para recoger y concentrar los microorganismos de la muestra ambiental, refiera por favor a la enseñanza de las Ciencias JoVE video de extracción de ácidos nucleicos de comunidad.
- Extracto de RNA de virus utilizando un kit de extracción comercial según las instrucciones del fabricante.
- Brevemente, primero se mezclan las muestras con tampón de lisis con etanol, después añadir las muestras en las columnas de la vuelta.
- Centrifugue las columnas a aproximadamente 12.000 x g, flujo de descarte. Añadir tampón de lavado a las columnas y centrifugue de nuevo.
- Añadir agua libre de ARNasa a las columnas y centrifugue durante 30 s para eluir el RNA en los tubos del microfuge de baja adherencia de 1,5 mL estéril.
4. Invierta la transcripción - PCR
- Recuperar los siguientes reactivos en el congelador de-20 ° C: dNTP, concentrado (por ejemplo, 10 x) inversa buffer de transcripción, cartillas (en este ejemplo, primers al azar). Descongelar estos en hielo o a temperatura ambiente dentro de una campana limpia y mantenerse en hielo descongelado. También recuperar la transcriptasa reversa y un inhibidor de RNasa y mantener en hielo.
- Calcular los volúmenes de reactivo necesarios para hacer una "mezcla maestra" que combina todos los reactivos constantes entre cada reacción (ver tabla 1 para una reacción de la muestra). Preparar suficiente mezcla maestra para cada muestra, así como un control positivo (con una plantilla de transcripción conocido) y negativas (p. ej., sin transcriptasa inversa, con agua como plantilla, etc.) reacciones de control. Incluyen un 10% adicional en el volumen.
- Montar la mezcla principal en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL baja adherencia. Esto minimiza el atascamiento de las moléculas de reactivo para paredes de los tubos de plástico.
- Cuando los reactivos son descongelados, añadir volúmenes calculados para el tubo de microcentrífuga. Suavemente el vortex y centrifugar cada tubo antes de la adición. Asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre adición de cada reactivo para evitar la contaminación.
- Después de todos los reactivos se han añadido, vortex y centrifugar la mezcla principal para asegurar una mezcla homogénea. Vuelva a colocar los reactivos en almacenamiento a-20 ° C.
- Preparar y etiquetar el tubo 8 tiras PCR, que designa un tubo para cada muestra o control de la reacción.
- Parte alícuota de un volumen igual de la master mix a cada tubo. Luego, añadir componentes de reacción específicos, tales como los extractos de RNA.
- Coloque la tapa de la tira firmemente en la franja de PCR y centrifugar en una minicentrifuge con un adaptador de tubo tira para asegurar todo el líquido se recoge en la parte inferior de cada tubo (figura 2).
- Tira de lugar PCR en termociclador. Presione hacia abajo para que los tubos estén asegurados.
- Establecer el termociclador para ejecutar el programa apropiado para el RT se utiliza (ver tabla 2 para un protocolo de muestra). Cuando el programa es completo, los tubos contienen productos de cDNA, que luego pueden ser sometidos a la amplificación de la polimerización en cadena. Para obtener más información, consulte los videos de JoVE Ciencias de la educación en PCR y PCR cuantitativa. Tienda cDNA a-20 ° C hasta su uso.
Figura 2. Tira de 8-tubo tapada que contiene extracto y mezcla principal.
| Reactivo de | Volumen por 1 reacción (μL) |
| 10 x Buffer de RT | 2.0 |
| 25 x dNTPs | 0,8 |
| 10 x cartilla al azar | 2.0 |
| Multiscribe | 1.0 |
| Inhibidor de Rnasa | 1.0 |
| Grado molecular H2O | 3.2 |
| Volumen total | 10 |
Tabla 1. RT amo mezcla los ingredientes.
| Paso 1 | Paso 2 | Paso 3 | Paso 4 |
| 25 ° C, 10 min. | 37 ° C, 120 min | 85 ° C, 5 min. | 4 ° C, ∞ |
Tabla 2. RT reacción termociclador programa.
Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa, o RT-PCR permite la detección de los virus ARN y genes microbianos en el medio ambiente.
A diferencia de organismos celulares de los seres humanos a las bacterias, que utilizan el ADN como su material genético, algunos virus tienen genomas de ARN, incluyendo muchos patógenos virus como la gripe, el Ebola y el VIH. Mientras que algunos virus pueden ser detectadas observando el fenotipo patógeno que se desarrolla cuando se utiliza para infectar células en cultivo celular, una mayoría no tiene ningún método de caracterización basada en la cultura. RT-PCR puede utilizarse para detectar la presencia de estos virus en el ambiente con alta sensibilidad.
Al mismo tiempo, organismos con genomas de DNA-basados "expresan" la información genética codificada en su genoma de ADN por "transcribir" en messenger o "m" RNA, que puede entonces ser "traducido" proteínas para realizar función estructural o enzimática en las células. Microbios responderán y adaptan a los cambios en el ambiente por dar vuelta encendido o apagado de diferentes vías genéticas, RT-PCR puede utilizarse para supervisar tales alteraciones en la expresión génica para servir como potenciales evaluadores de ecosistema.
Este vídeo pasará sobre los principios detrás de RT-PCR, detallar un procedimiento generalizado para realizar esta técnica y por último, examinar algunas de las formas de que este método se aplica en Microbiología Ambiental hoy.
Hay dos partes fundamentales de este procedimiento: la extracción de RNA de muestras biológicas, seguido de su transcripción inversa en el ADN.
El aislamiento de ARN consiste en lisis de las células en la muestra mediante la adición de un detergente que descompone los lípidos y proteínas, seguidas por la interrupción mecánica. Extracción de RNA de virus generalmente requiere la adición de proteinasas, que son los que digieren la proteína enzimas para romper la cápsida de los virus - las capas de proteína dura que forman la partícula viral. Por otro lado, cuando obtener RNA en organismos celulares, lisado puede necesitar ser tratados con enzimas degradadoras de ADN, o DNAases, para evitar resultados abajo están confundidos por la presencia de la DNA químicamente similar.
RNA se puede entonces purificar de lisados de dos maneras. En un método conocido como extracción de ácido Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo, lisado se mezcla con una mezcla orgánica acuosa que luego se centrifuga para separar las fases. Las proteínas se reparten en la fase orgánica, restos de células sometidas a lisis en la interfase nublada y los ácidos nucleicos en la fase acuosa. Entonces se puede recoger la fase acuosa superior y RNA se precipita por adición de alcohol como isopropanol, que disminuye la solubilidad del ácido nucleico en el agua.
En aislamiento de RNA base de columna, el lisado se mezcla con alcohol y luego pasa a través de una columna de gel filtración con una resina cargada negativamente, tales como sílice. El lisado es preparado para que los iones cargados positivamente en la forma de tampón "puentes de sal" que permiten a la espina dorsal del fosfato cargado negativamente de los ácidos nucleicos para enlazar a la resina. Otros contaminantes son luego arrastrados. Los ácidos nucleicos son "eluidos" de la columna usando un tampón de baja en sal o agua. RNA monocatenario tiene menos cargas negativas que el ADN de doble hebra, se puede ser preferentemente eluyó utilizando búferes de concentraciones específicas.
Una vez aislado, el ARN se transforma en el ADN más químicamente estable. Los científicos han utilizado una enzima natural codificada por retrovirus como el VIH. Esta enzima es conocida como transcriptasa inversa, o "RT".
RT sintetiza el ADN complementario o "c" de un tramo corto de nucleótidos conocido como imprimación. Esta cartilla puede tener diferentes secuencias, dependiendo de la finalidad del experimento. Por ejemplo, la cartilla puede diseñarse para tener una secuencia específica, para la detección de genes específicos o los organismos. Una vez sintetizado, este cDNA "primera cadena" puede se amplifica por PCR regular.
Ahora que tenemos una comprensión de los principios detrás de RT-PCR, echemos un vistazo a un protocolo para la realización de esta técnica en RNA de muestras recogidas del ambiente.
Para comenzar el procedimiento, encontrar un punto de recogida de muestra mediante coordenadas GPS o la vista. Seleccione puntos al azar dentro de un área para obtener un estudio general de los hábitats microbianos.
Para recolectar la muestra sólida, empuje y gire un taladro de mano en el suelo de tierra a la profundidad predeterminada. Al levanta la barrena, suelo puede encontrarse en el tallo hueco de la barrena.
Este suelo es raspado directamente en un bolso de la colección de suelo y la bolsa está etiquetada con la ubicación, nombre, fecha, hora de recolección y cualquier otra información necesaria.
Transferencia de la tierra al laboratorio y pasar el suelo a través de un tamiz de 2 mm para extraer grava y roca. Analizar una muestra de suelo para contenido de humedad, que puede ser informativo sobre el nivel de actividad microbiana en el suelo. Para hacer esto, consulte video "determinación de humedad contenido de suelo" de esta colección.
Para recolección de muestras de agua, elegir un sitio de interés similar a la colección de suelo y recoger el agua en una botella de plástico estéril pared gruesa. Tome nota del volumen de agua recolectada. Prueba el agua inmediatamente para parámetros como temperatura, pH y salinidad, que puede proporcionar información importante acerca de los niveles microbianos esperados en la muestra. Luego, coloque la botella en el refrigerador y traslado al laboratorio.
Microorganismos como los virus son recogidos y concentrados de la muestra ambiental.
RNA se puede extraer de los virus recogidos por el método de columna de vuelta usando kits comerciales de extracción de RNA según instrucciones del fabricante. Tampón de lisis, con etanol, se mezcla primero con la muestra. Coloque el número apropiado de columnas spin en tubos, luego aplicar las muestras en la matriz de la columna. Las columnas de aproximadamente 12.000 x g durante 1-2 min dejar que los ácidos nucleicos se unen a la columna y deseche el líquido flujo a través de centrífuga.
Añadir tampón de lavado a las columnas y centrifugue de nuevo. Colocar las columnas en los tubos del microfuge nueva y estéril 1,5 mL baja de la adherencia. A continuación, añadir agua libre de RNasas, que son enzimas que degradan RNA, para las columnas y centrifugue durante 30 s a fin de eluir el RNA. El ARN eluído puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso.
Antes del experimento, adecuados primers deben estar diseñados con el fin de detectar las secuencias de interés, que pueden servir como marcadores para la presencia de microorganismos específicos.
Sacar los reactivos de RT almacenados a-20 ° C y descongelar los reactivos congelados en el hielo (o a temperatura ambiente). Estos incluyen nucleótidos, buffer de transcripción reversa y cartillas. Una vez descongelado, mantener los reactivos en el hielo; la enzima transcriptasa reversa y el inhibidor de la Rnasa siempre debe mantenerse en hielo.
Mientras que los reactivos están deshelando, calcular los volúmenes y concentraciones de los componentes de la reacción. Una vez que los reactivos son descongelados, suavemente vortex y vuelta cada tubo para asegurar el contenido estén bien mezclados.
Trabajar en campana de flujo laminar para evitar la contaminación, ensamblar los componentes en una mezcla maestra para agregar a cada tubo PCR. Al montar la mezcla principal en un tubo Eppendorf, asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre cada reactivo para evitar la contaminación. Después de todos los reactivos se han añadido al tubo Eppendorf, vortex y giro el maestro mezclan suavemente el tubo para asegurar una mezcla homogénea.
Etiquetar un conjunto de tubos PCR, asegurándose de incluir controles. Parte alícuota de un volumen igual de la mezcla principal en cada tubo. Luego, añadir componentes de reacción específica, como el agua para el control negativo o extractos de RNA.
Una vez que se agregan todos los componentes, coloque los tubos en un termociclador y establecer el programa de transcripción reversa para ejecutarse. El cDNA puede ser sometido luego a la amplificación por PCR. Para una descripción detallada de este paso, consulte el vídeo de la colección en la PCR.
Cuando se completa la polimerización en cadena, algunos de los productos PCR pueden ser separados y visualizados en un gel de agarosa. Por ejemplo, una cartilla gene-específica fue utilizada aquí para detectar la presencia de un virus de ARN. Bandas del tamaño esperado se obtienen de la reacción de RT-PCR pero no de los controles negativos, indicando la presencia de este virus en la muestra de agua poniendo a prueba.
La identificación de microorganismos basados en RNA por RT-PCR permite el análisis de riesgos ambientales, salud ecológica y la conservación de la biodiversidad.
El uso de microorganismos para limpiar hidrocarburos y disolventes de aguas y suelos contaminados representa una alternativa de remediación ecosostenible. Comprensión expresión genética microbiana nativa puede destacar vías microbianas específicas que descomponen contaminantes en estas condiciones. RT-PCR a menudo se utiliza para amplificar mRNA de tales muestras ambientales.
Medidas de salud pública a menudo requieren vigilancia rápida de fuentes virales de la infección en el medio ambiente. La gripe aviar, por ejemplo, es altamente contagioso y puede propagarse rápidamente y las aves de corral, ganado, incluso los seres humanos. En este ejemplo en concreto, los investigadores buscaron la amenaza de la gripe aviar transmitida por aves silvestres.
Utilizando una instalación portátil de RT-PCR y aparatos, proyectó una variedad de aves silvestres, incluso en áreas remotas, para detectar las infecciones temprano y prevenir la transmisión.
Por último, RT-PCR puede utilizarse para caracterizar "biopesticidas" desarrollados a parásitos de la blanco como la Chicharrita de alas cristalinas Homalodisca vitripennis, el propietario de una enfermedad que daña seriamente la vid en América del norte. Un nuevo virus de ARN monocatenario está siendo desarrollado como un agente para infectar a este insecto. Usando una combinación de cultivo celular de Homalodisca y confirmación de RT-PCR de la carga viral, estos autores fueron capaces de propagar una alta concentración de virus para su uso como un agente de control biológico.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a los organismos ambientales Analyzing RNA-Based por RT-PCR. Ahora debería entender la teoría detrás del Protocolo, cómo aplicar la técnica a su investigación y algunas de las formas en que se está utilizando en el campo hoy. ¡Gracias por ver!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Cuando RT - PCR es completa, algunos de los productos PCR pueden separados y visualizados en un gel de agarosa (figura 3). En este ejemplo, se utilizó una cartilla gene-específica para detectar la presencia de un virus de ARN. Bandas del tamaño esperado se obtienen de dos de las muestras y la reacción de control positivo, pero no del control negativo, indicando la presencia de este virus en dos de las muestras de agua poniendo a prueba.
Figura 3. Electroforesis en gel de los productos de RT-PCR. M: marcador de tamaño de ADN; P: control positivo; N: control negativo. Reacciones con RNA de cuatro muestras de agua fueron funcionadas en los carriles 1, 2, 3 y 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
RT-PCR es necesario para la creación de cDNA de una plantilla de RNA. Esto permite que microorganismos basado en RNA ser analizados utilizando análisis moleculares desarrollados por ADN. Una vez que es sintetizado el ADNc, análisis PCR pueden determinar la presencia o ausencia de microorganismos basados en RNA dentro de una muestra ambiental. Esto permite más análisis aguas abajo para determinar la ecología microbiana, riesgos para la salud y los riesgos ambientales.
RT-PCR también puede ser utilizado para análisis de mRNA como un medio para observar qué genes se expresan en un ambiente. Esto proporciona información acerca de que proteínas y vías de microbios dependen para sobrevivir, en particular, las condiciones ambientales. Análisis de expresión génica pueden identificar vías microbianas contaminantes ambientales de degradación tales como hidrocarburos o solventes clorados, y microbios con estas vías pueden aprovecharse para la biorremediación.
Evaluación de riesgos incorpora RT-PCR para analizar riesgos para la salud humana y ambiental. La combinación de RT con PCR cuantitativa permite virus del RNA a enumerar dentro de muestras, para que la exposición humana y ambiental puede ser calculada con el propósito de evaluación cuantitativa de riesgo microbiano (QMRA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
