Overview
ソース: 博士ポール亭 - パデュー大学講座
標準の追加のメソッドは、目的の標本にマトリックス効果、どこ追加コンポーネントが減らすか、または試料の吸光度信号を高めるために複数のコンポーネントがある場合にしばしば使用されている定量分析方法です。分析結果に重大なエラー結果します。
標準的な追加は、マトリックスが均等にすべてのソリューションを影響が予想されますので、測定からマトリックスの影響を除去するために使用されます。また、それは化学物質を修正する使用されます相分離抽出プロセスで実行します。
不明なソリューションの実験 (この場合蛍光) 強度を読むし、追加既知の標準の変化量と未知の強度を測定することによって、メソッドが実行されます。データは蛍光強度対.追加標準量としてプロットされます (追加、基準なしの未知の世界自体は y 軸にプロットされる)。二乗ラインは、図 1に示すように、未知の濃度の負の x 軸を交差します。
図 1.標準添加法のグラフィック表現です。
Principles
この実験では、標準の追加法は分析ツールとして示されています。メソッドは、典型的な較正曲線の生成しない種の定量分析のためのプロシージャです。標準添加分析を実現するには、前に、試料の知られている標準液の正確な因数の付加の後の発光スペクトル強度を測定します。
この実験の反応による非蛍光性種の研究それら蛍光錯体を形成するように。この方法は、金属イオンの調査に使用されます。アルミニウム イオン (Al3 +) は、8-ヒドロキシキノリン (8HQ) と複合体を形成することによって決定されます。Al3 +は水溶液からの 8HQ によって引き起こされる、クロロホルムに抽出し、クロロホルム溶液の蛍光測定は、オリジナル Al3 +溶液の濃度に関連します。百万ごとの部分 (ppmまたはG/ml) 範囲で感度は、この実験の予定です。
反応が
この実験中に各サンプルのアルミニウムの使用量として計算されます。
| 空白 | 0 | ||
| 不明な + 0 mL 標準 | V未知(C未知) = 25 mL (C不明) | ||
| 不明な + 1 mL 標準 | V未知(C不明) + V標準(C標準) = 25 mL (C不明) + 1 mL (1 μ g/mL) | ||
| 不明な + 2 mL 標準 | V不明です(C不明) + V標準的です(C標準) = 25 mL (C不明) + 2 mL (1 μ g/mL) | ||
| 不明な + 3 mL 標準 | V不明です(C不明) + V標準的です(C標準) = 25 mL (C不明) + 3 mL (1 μ g/mL) | ||
| 不明な + 4 mL 標準 | V不明です(C不明) + V標準的です(C標準) = 25 mL (C不明) + 4 mL (1 μ g/mL) | ||
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Procedure
1. 試薬の準備
- 100 ppm 標準 Al3 +ソリューション: DI 水を 1 L メスフラスコにディゾルブ 0.9151 g アルミニウム硝酸塩 (Al (3)3•9H2O)。
- 8HQ ソリューション 1 M 酢酸 (2 %wt/巻): 8-ヒドロキシキノリンの 2.0 g を 100 mL のメスフラスコに追加。
- 慎重に 100 mL フラスコに 5.74 mL の氷酢酸を追加し、DI 水が付いている印に希釈します。これは液相に溶解する 8-オキシキノリンをことができます。
- 1 M NH4+/NH3バッファー (pH ~ 8): 酢酸アンモニウム (NH4OAc) 20 g を 100 mL のボトルに追加。
- この 100 mL ボトルに 30% アンモニア水 7 mL を追加し、DI 水のマークを希薄化します。これにより、8HQ ソリューションを組み合わせるときの酸を中和します。
- その他の試薬は無水硫酸ナトリウムを含む (Na2SO4) とクロロホルム (スペック グレード)。
2. サンプルの準備
- Al3 +ソリューション ピペットで 100 ppm 株式の 1.0 mL を 100 mL のメスフラスコに追加することによって 1.00 ppm 標準 Al3 +ソリューションを準備します。
- ボンネットにある大型のリング スタンド上にあるリングに 6 125 mL, 目標到達プロセスを配置します。彼らは次のようにラベル付けされる必要があります: BL、0、1、2、3、4 です。 ガラス製品すべてが綿密にきれい、クロロホルムの小さなビーズは、ガラスの壁に固執する場合、量的な結果を得ることが困難であることを確認します。
- 5, 目標到達プロセス 0、1、2、3 をラベルに不明な Al3 +ソリューションの 25.00 mL を追加 & 4。この例では、未知の濃度は 0.110 ppm です。
- 1 mL ピペットで 5 目標到達プロセスにそれぞれ、4.00 1.00 ppm 標準 Al3 +溶液、mL、3.00 2.00 1.00 0 を追加します。
- 黒ラベル, 漏斗に 25.00 mL の蒸留水を追加することによって、空白を準備します。
- それぞれの六つのソリューションに 1.0 mL のピペットで 8-ヒドロキシキノリン溶液を追加します。
- それぞれの六つのソリューションにピペットで緩衝液 3.0 mL を追加します。
- 2 回各時間 1 分は積極的に揺れクロロホルム 10 mL で各ソリューションを抽出します。圧力集結を解放する, 漏斗を時折口に注意してください。(注: 良い抽出のみ行われるフェーズ間の液-液接触の多くがある場合)。
- 清潔で乾燥した 100 mL のラベルの付いたビーカーにクロロホルムを収集します。クロロホルムので、それは下層の密度を 1.5 g/cm3、閉じる。完全な抽出した水相でに黄色左のトレースをする必要がありますはありません。
- それぞれ 25 mL メスフラスコに各ビーカーから結合されたクロロホルム抽出を転送し、クロロホルムが付いている印に希釈します。必ず、クロロホルムが蒸発するを防ぐために各のメスフラスコにストッパーを配置してください。
- 無水硫酸ナトリウムの ~ 1 g を追加 (Na2SO4) ステップ 2.9 から 6 100 mL ビーカーのそれぞれに。硫酸ナトリウム クロロホルム抽出物に存在する水の痕跡を削除することができます。
- ソリューションを彼らの敬われたビーカーに転送します。サンプルの水の脱水を促進する慎重に旋回。
- 石英蛍光セルにクロロホルム抽出をデカント (注: クロロホルムをプラスチックのポリスチレン セルを解散する)。
3. 励起波長を選択します。
スキャンを実行することによって励起し、発光波長を決定し、単に読み、これらの値のすべてのサンプルの蛍光強度を記録します。励起と発光帯域幅が 5 であらかじめ設定されて nm。励起波長は約 385 をする必要がありますので、近い紫外線の複合体が吸収する nm。当初、500 で蛍光をモニター発光支店で nm。
- 蛍光、両方の内部および外部冷却ファン、蛍光ではキセノン ランプの電源投入前にオンにことを確認します。キセノン ランプは非常に熱く、継続的な冷却が必要です。
- 400 V に PMT 検出器に高電圧 (HV) オンにします。
- シャッターの両方を開きます。
- コンピューター上のデータ集録プログラムを開き、ここでは"100nmFluorScan"。
- 「サンプル + 追加 2 mL」を置く最高の励起・発光波長を決定するために使用する石英セルに (2) ソリューション。
- 500 で設定当初発光波長 nm、2 nm/秒のスキャン速度と 335 435 nm から励起スキャンを実行します。
- 結果として得られる蛍光プロット (EXλ最大)、最大蛍光励起波長を決定し、その値に計測器を設定します。
4. 発光波長を選択します。
- 450 に蛍光発光波長を設定 nm。
- 発光波長範囲 450-550 nm から 100 nm スキャンを実行するを設定します。
- スキャンを開始するには、蛍光のフロント パネルの「スタート」ボタンを押すと同時にプログラムに「試験開始」ボタンをクリックします。
- 結果として得られる蛍光プロット(EMλ最大)、最大蛍光波長を決定し、その値 (図 2) に楽器を設定します。
図 2。最適な EXλ のmaxと EM を決定するλmax 波長。
5. サンプルの蛍光性の測定
- すべてのサンプルは、EMλmaxと EXλmaxで実行されます。これらの条件における蛍光値だけで、各サンプルのスキャンは不要です。最も希薄サンプル (空白) にはじまって、石英セルで、楽器を配置します。蛍光強度を実験室のノートに記録します。
- 他のすべてのサンプルに対して繰り返します。
- 覚えて空の相対強度が相対的強度校正チャートを作成する前に各ソリューションから減算しなければなりません。
6. 標準添加プロットを作成します。
- Al3 +追加の μ g 対蛍光強度をプロットします。
- 結果プロットの二乗値を決定し、傾きと切片の両方を記録します。
- Al3 + Al3 +の方程式 μ g から未知のサンプルでの μ を決定 -b/m を =
- 不明なアルミが 25.0 mL 各サンプルに追加の量を持っていたことを知って、未知の世界のアルミニウムの濃度を決定します。
標準添加法は、検体測定信号に干渉するマトリックスの影響を最小限に抑えるため定量分析手法です。
不明な成分濃度はしばしば光分光法、質量分析法、電気化学などの分析技術の範囲を明らか。ただし、測定は、マトリックスと呼ばれる、サンプルの他のコンポーネントによって影響を受けることができ、不注意による削減やマトリックス効果と呼ばれる、信号の強化を引き起こします。これらの効果は、結果を歪曲し、解析で重大なエラーが発生できます。
標準添加法は、測定信号のマトリックスの影響を最小限に抑えるために使用できます。これは、既知の試料溶液の正確なボリュームをサンプルに追加することによって実行されます。
このビデオは標準添加法の基本を紹介し、蛍光測定を用いた実験の手法を実行する方法を示します。
マトリックス効果では複雑なサンプルに他の分子の数が検体と対話が生じる。たとえば、分子をバインドまたは蛍光を発する能力を変更することにより、試料の塊を形成するときにも発生する可能性が。またはマトリックス試料の特定のプロパティを変更するソリューション全体のイオン強度を変更可能性があります。
標準添加法を使用してこれらの効果を軽減するために試料標準液量の範囲は、サンプルの平等なボリュームに追加されます。ソリューション ボリュームになります同じを使用して溶剤。
その後、信号がサンプルと標準添加なしの測定します。データは、標準的な追加に古典的な検量線ではなく、サンプルの量対強度としてプロットされます。任意の指定されたフラスコに試料の実際の濃度は次の式によって定義されます。楽器の応答いくつかの一定時間試料の濃度と等しくなります。得られた方程式は線形形式 y = mx+b と。したがって、プロットは吸光度をゼロに外挿する、切片はサンプルの未知濃度に等しいです。
信号のプロットは、懸念の濃度範囲で線形である必要があります。また、サンプル マトリックス変更に analyte の比率としては干渉が変わらないようにします。最後に、行列自体は独自に測定信号を生成しないでください。
次の実験研究アルミニウム、非蛍光性種で 8-オキシキノリンや 8HQ、複雑な蛍光 ALQ3を形成する反応します。
複雑な有機溶媒中でのアルミニウムの蛍光は、測定し、元のアルミニウム溶液の濃度に関連しています。この方法は、金属イオンの分析では一般的です。
標準添加法の基本が記載されているし、実験の基本の説明、研究室で手法を実行してみましょう。
まず、水で 100 ppm アルミ ストック ソリューションを準備し、1 ppm の標準ソリューションを準備するそれを使用します。
次に、100 mL のメスフラスコに 8-ヒドロキシキノリンの 8HQ、2 g を追加します。
慎重に 5.74 mL の氷酢酸を追加し、脱イオン水 100 mL マークに希釈します。この手順により、水相中に溶解する 8HQ です。
次に、7 mL 30% 水酸化アンモニウム酢酸アンモニウム 20 g を 100 ml マークに追加することによって、バッファーを準備し、希釈します。PH インジケーター棒で pH を確認してください。このバッファーは、8HQ ソリューションを組み合わせるときの酸を中和するのに役立ちます。
その他の試薬は必要な無水硫酸ナトリウムおよび吸光光度等級クロロホルムに含まれます。
液-液抽出法を用いた有機相に水のサンプルを抽出することによってこの場合サンプルを準備します。フード内側リング スタンド リングに 6 125 mL, 目標到達プロセスを配置します。すべてのガラス製品は、汚れたガラス結果のスキューが綿密にきれいであることを確認します。順番にラベル、目標到達プロセスの「空白」、「0」、「1」、「2」、「3」と「4」。
ピペットを使用すると、「0」から「4」というラベルの付いた, 5 つの目標到達プロセスのそれぞれに不明なアルミニウム溶液の 25 mL を追加します。空白を準備するには、"blank"というラベルの付いた漏斗に 25 mL の脱イオン水を追加します。
次に、対応する番号の付いた目標到達プロセスに 1、2、3、および 1 ppm の標準溶液 4 mL を追加します。目標到達プロセスを空白または 0 に標準溶液を追加しません。
6 の目標到達プロセスのそれぞれに 1 mL 8HQ ソリューションと緩衝液 3 mL を追加します。
液-液抽出を実行するには、各フラスコにクロロホルム 10 mL を追加します。目標到達プロセスを積極的に振るし、時折圧力集結を解放する漏斗をぶちまけます。目標到達プロセス、リングに戻し、分離する液体層を許可します。
次に、清潔で、乾燥しラベル 100 mL ビーカーにクロロホルム段階を収集します。クロロホルムは水よりも密度が高いため、漏斗で下位層です。
25 mL のメスフラスコにクロロホルム抽出を転送し、蒸発を防ぐために各フラスコのキャップします。
残りの水溶液に 2 番目の液-液抽出を実行するには、各ファンネルにクロロホルム 10 mL を追加します。クロロホルム段階に任意の残りの検体を転送する前に、目標到達プロセスを振る。トップの水相に黄色の色はないはずです。
各目標到達プロセスの 2 番目の抽出を繰り返し、ビーカーをラベル対応したクロロホルム段階を収集します。彼らのそれぞれのメスフラスコに収集したクロロホルムを注ぐし、新鮮なクロロホルムが付いている印に希釈します。
微量水分を削除するには、各六つの 100 mL ビーカーに無水硫酸ナトリウム約 1 g を追加します。サンプルの脱水を促進する旋回し、ソリューションをそれぞれのビーカーに転送します。
石英蛍光セルにクロロホルム抽出をデカントします。
メーカーの指示に従って蛍光を設定し、電圧を 400 V に設定します。次に、コンピューター上のデータ集録プログラムを開きます。
サンプル 2 を使用して、最高の励起・発光波長を決定します。500 nm と実行、励起スキャンから 335-435 nm、2 nm/秒のスキャン速度に発光波長を設定します。
蛍光のプロットから最大励起波長を決定します。楽器をこのケース 399 nm で励起波長値に設定します。
次に、450-550 nm からスキャンを実行することによって発光波長を決定します。結果蛍光プロット最大波長を決定し、この場合 520 nm の発光波長を設定します。
選択した励起と放射の波長で空白を含む、各サンプルを測定します。それぞれの蛍光強度の読書を記録します。
その他の 5 つのサンプルのそれぞれから空白のサンプルの測定された蛍光を減算します。
サンプルに追加アルミの量と 5 つのサンプルのそれぞれの蛍光強度をプロットします。結果プロットの二乗値を決定し、傾きと切片を記録します。
追加アルミの量対蛍光強度のプロットは、示すように、最小二乗ラインをもたらした。サンプル中のアルミニウムの量は、この行を使用して計算できます。未知の追加の量 25 mL、確定値であったので、2.916 μ g は 25 mL で割ります。これは 0.117 μ g/mL、または 0.117 ppm の最終的な結果を与えます。これは、かなり 0.110 ppm の既知の値に近いです。
今、マトリックスの影響により結果を傾斜がすることができますいくつか他の分析手法を見てみましょう。
原子吸光法は、ターゲットによって気体段階の光の吸光度を測定する分析法です。ほとんどのサンプルのサンプル濃度吸収に関する簡単な検量線は未知の濃度を定量化する信頼性の高い方法として使用できます。
ただし、この手法は、混合物の他のコンポーネントにターゲット analyte と対話して抑制や吸収を高める場合、精度を失うことができます。標準添加法は、分析の前に行列を削除できませんサンプルを中心に、これらの相互作用の効果を考慮するこのケースで使用できます。
測定器の校正は、測定精度の重要な役割を果たしています。標準添加法は、ICP さん ICP-MS は比較の方法では、未知の試料の測定が標準的な化学物質の測定に基づいていることを意味など計測器の校正を支援するためによく使用されます。
したがって、未知の測定の不確かさは、校正の不確かさをよりすることはできません。標準添加法は、標準的な方法より正確です、サンプル マトリックス相互作用の検量線を作成するため使用できます。
多くの生体分子の分析には、高速液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いてします。高速液体クロマトグラフィーは、分離し、分子の極性、料金、サイズなどのプロパティに基づいた複雑な混合物を分析する手法です。列が試料の状態を時間では、混合物内の各コンポーネントを識別できます。
生体分子は多くの場合混合物で対話できるし、宙にマトリックスによって大きく影響を受けます。多くの場合、標準添加法を使用して、これらの影響の占めている検量線を作成します。
ちょうど標準添加法にゼウスの導入を見た。今サンプル分析のマトリックスの影響を考慮する手法を実行する方法を理解する必要があります。
見てくれてありがとう!
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Results
励起波長 335-435 からのスキャンは、399 で最高の吸収を示した nm、ので励起分光器がその値に設定されていました。450-550 nm からエミッション スキャンを行ったし、最も強い信号が 520 でことが判明した nm。これらは、すべてのサンプルに使用される波長です。
| サンプル | 蛍光強度 | 補正後の蛍光強度 |
| 空白 | 0.008 | 0.000 |
| サンプル | 0.128 | 0.120 |
| サンプル + 1 mL | 0.167 | 0.159 |
| サンプル + 2 mL | 0.220 | 0.212 |
| サンプル + 3 mL | 0.260 | 0.252 |
| サンプル + 4 mL | 0.290 | 0.282 |
Μ g の Al3 +追加 (図 4) 対蛍光 (図 3) のプロットの二乗ラインをもたらした。
蛍光強度 = 0.0417 (Al3 +追加の μ g) x + 0.1216
Al3 +の量-(Y-Int)/斜面を =-0.1216/0.0417 =-2.916 = μ G/ml
以来、未知の追加の量は 25 mL、2.916 μ g/mL 値を 25 で割った値に必要があります。
不明なアルミニウム濃度 = 2.916 μ g/mL/25.0 mL = 0.117 μ g/mL = 0.117 ppm
かなり 0.110 ppm (6.4% エラー) の実際の値に近いです。
図 3。サンプルの蛍光。
図 4。標準添加校正プロット。
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Applications and Summary
標準の追加のメソッドは、多くの場合原子吸光、蛍光分光法、誘導結合プラズマ発光、ガスクロマトグラフィーなどの分析の分析で使用される正確な定量的な結果が必要なときに利用手法です。これは、削減または定量的な結果を得るのため必要な吸光度の強化目的の標本でその他のコンポーネントがある場合によく使用されます。これは、場合は、1 つ単に伝統的な校正曲線のアプローチを使用して標準検体信号を比較することはできません。実際には、マトリックス効果評価検証手順の必須の部分をする必要があります。
標準の追加機能を使用できる別の例は、古い写真廃棄物からの銀の抽出です。廃棄物はハロゲン化銀が含まれているし、銀をクリアできるように抽出することができます。銀の知られていた量の不明な「無駄」を打ちつけることによってこのメソッドは、写真フィルムから得られた銀の量を予測できます。
ベンゼン製造工場にさらされている労働者はしばしば、彼らは安全にベンゼンの受け入れレベルを下回っていることを確認するテストされ。化学工業、彼らの尿をテストし、生物学的マトリックスであります。また、単一の校正キットは動作しませんので、検体抑圧量は異なった人々 のため異なります。標準添加法とは、すべての従業員をテストおよび正確に評価できます。
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