Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner
La calidad del agua destinada para el uso en ajustes agrícolas, recreativos y domésticos es de gran importancia debido al potencial de brotes de enfermedades transmitidas por el agua. Agentes microbianos implicados en tales acontecimientos incluyen parásitos, bacterias y virus que están en alto número en las heces de personas infectadas y animales. Transmisión a los anfitriones nuevos y susceptibles luego puede ocurrir vía la ruta fecal-oral por ingestión de agua contaminada. Por lo tanto, la capacidad para monitorear las fuentes de agua para la presencia de microorganismos patógenos es importante para garantizar la salud pública.
Debido al gran número y variedad de patógeno fecal-oral potenciales que pueden estar presentes en el agua y sus concentraciones variables, resulta poco práctico y caro de ensayo directamente para cada uno de ellos sobre una base regular. Por lo tanto, los ensayos microbiológicos para el control de la calidad del agua emplean bacterias coliformes indicador. Coliformes comprenden, en parte, la microflora intestinal normal de los mamíferos de sangre caliente, son no patógenas y constantemente se excretan en las heces. Por lo tanto, la detección de bacterias coliformes en el agua significa que se produjo un comunicado de fecal, y que microorganismos patógenos perjudiciales pueden también estar presentes.
Principles
La técnica de filtración de membrana se utiliza para evaluar la calidad microbiológica del agua ensayando para las bacterias del indicador fecal. Una cantidad de agua (por ejemplo 100 mL) se pasa a través de un filtro de membrana especializada con un tamaño de poro promedio mínima de 0.45 μm, facilitando la captura de las bacterias, ya que son aproximadamente 1 μm de tamaño. Después de filtración, la membrana cuidadosamente es aplicada a un medio de cultivo especializado de agarosa y se incubaron bajo las condiciones adecuadas a la cultura de los microorganismos objetivo.
Cuando se aplica para el uso en el control de la calidad del agua, filtración de membrana es más ideal para fuentes de turbiedad baja tales como agua potable, piscinas y aguas recreacionales naturales como lagos y embalses. Aguas altas en materia de partículas (por ejemplo aguas residuales) resultará en la suciedad del filtro; por lo tanto, sólo pequeños volúmenes (p. ej. 100 mL) puede ser analizada. También, la filtración de membrana no es práctica para fuentes de agua con las bacterias de gran número de fondo (o no coliformes), que pueden aumentar la dificultad de la enumeración de las bacterias coliformes blanco en la incubación siguiente medio de agarosa.
Este video muestra la colección de muestras de agua ambiental y agua potable, la filtración de membrana de las muestras y la enumeración de los distintos tipos de colonias bacterianas indicador fecal utilizando medios de cultivo especializados agarosa incluyendo coliformes totales, coliformes fecales y enterococos fecales. Realizan las pruebas más para comprobar la presuntos colonias también se muestran.
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Procedure
1. recogida de muestras y procesamiento del agua
- Recoger varias muestras de 1 L de agua de la fuente de agua de prueba (por ejemplo, fuentes de agua, piscinas, embalses, sistemas de distribución de agua, aguas residuales crudas o tratadas) y transporte en hielo al laboratorio para su análisis microbiano.
- Esterilizar o desinfectar el conjunto múltiple de filtración de membrana antes de uso en autoclave, exposición a ignición de radiación (2 min), o etanol de la llama de UV.
- A enfriamiento de todas las partes, conectar correctamente el múltiple a una bomba de vacío y vacío filtrado residuos frasco que contenga lejía.
- Etanol-llama esterilizar un par de pinzas y con ellas, quitar un filtro de membrana estéril, cuadriculada de su embalaje. Por lo general se utilizan membranas de 47 mm de diámetro con un tamaño de poro de 0,45 μm. Sin embargo, alternan diámetros y tamaños de poro pueden emplearse siempre que el tamaño del poro suficientemente puede atrapar los microorganismos de la blanco, y al menos 70% de la superficie de filtro se compone de espacio de poro.
- Coloque el filtro en el centro de la zona de filtración de membrana de los colectores y aplica un embudo de filtro estéril a la unidad y asegúrela en su lugar.
- Medir un volumen de agua de prueba (por ejemplo 100 mL) y agregarla en el embudo (una marca de 100 mL línea es visible en el embudo).
- Aplicar un vacío parcial [presión diferencial de 34 a 51 kPa (kilopascales)] para extraer la muestra a través del filtro. Total suspendido material sólido, incluyendo bacterias y descomposición de materia orgánica, mayor que el filtro de medio tamaño de poro de 0.45 μm son atrapadas en el filtro. Partículas más pequeñas incluyendo virus y sólidos disueltos tales como pequeñas cantidades de materia orgánica y sales, pasará a través de la membrana y en el matraz de vacío contenedor de residuos que contienen cloro.
- Tras la aprobación completa de la muestra a través del filtro, enjuague el interior del embudo con dos o tres volúmenes de 20-30 mL de agua estéril.
- Apagado el vacío y retire el embudo colector al cierre del enjuague final.
- Con pinzas estériles etanol-llama, inmediatamente retire el filtro de membrana de la unidad y colocarlo rápidamente en el medio de agarosa de crecimiento apropiado para el microorganismo de destino (la tabla 1 enumera las condiciones de incubación y los medios de crecimiento recomendado para cada uno).
- Aplicar el filtro de membrana en la superficie de agarosa con un movimiento de tipo rodillo para asegurar el contacto completo de la membrana con el medio de crecimiento y para evitar el atrapamiento de burbujas de aire.
- Vuelva a colocar el embudo de filtración usados con una unidad estéril entre el procesamiento de cada muestra y etanol-desinfectar el colector de acero inoxidable para evitar la contaminación cruzada.
2. Colonia (enumeración)
- Tras el período de incubación, retirar las placas de crecimiento de la incubadora para la enumeración.
- Lo ideal es realizar los recuentos de colonias bajo ampliación de baja potencia utilizando una fuente de luz fría, blanca.
- Coliformes totales
- Colonias de coliformes totales son típicamente rosadas a rojo oscuro en color con un brillo metálico de la superficie. El brillo puede cubrir parcial o totalmente la Colonia. Morfologías de colonias coliformes total anormal pueden ser rojo oscuro, nucleada sin brillo o mucoide.
- Las colonias que son rosa, azul, blanco o incoloro al carecer de brillo se consideran no coliformes.
- Coliformes fecales
- Colonias de coliformes fecales aparezcan como distintos tonos de azul.
- Nonfecal colonias de coliformes son de color gris a crema en color.
- Enterococos fecales
- Enterococos fecales colonias entre rosa y rojo oscuro en color.
3. Colonia verificación
- Coliformes totales
- Verificación de presencia-ausencia, limpiar la membrana entera usando un asa de inoculación estéril. Para las colonias, es preferible verificar por lo menos cinco cada de morfologías típicas y atípicas.
- Transferir la Colonia seleccionada en un recipiente de vidrio que contenga caldo de triptosa de laurilo con un tubo de Durham. Incubar los tubos inoculados a 35±0.5 ° C por 48 h. La presencia de crecimiento indicando turbidez conjuntamente con producción de gas verifica a la Colonia como un coliforme.
- Coliformes fecales
- Transferir asépticamente colonias de color azules en los recipientes de vidrio que contiene el medio estéril de CE con un tubo de Durham. Incubar los tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 ° C por 24 h. La presencia de crecimiento indicando turbidez conjuntamente con producción de gas verifica a la Colonia como un coliforme fecal.
- Enterococos fecales
- Huelga colonias representando morfología de enterococos fecales para aislamiento asépticamente en cerebro corazón infusión Agar (BHIA) e incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 a 48 h.
- Transferencia de crecimiento de una colonia aislada en BHIA sobre dos portaobjetos previamente limpiado.
- Añadir dos o tres gotas de peróxido de hidrógeno 3% a los borrones de transferencia preparados de las diapositivas. La rápida aparición de burbujas indica un resultado de "catalasa positiva", y el aislante no es una bacteria estreptococo fecal.
- Realizar una tinción de Gram para aislamientos pruebas como "catalasa negativa" (sin burbujas observadas). Enterococos fecales son bacterias Gram positivas, ovoides y aparecen sobre todo en parejas o cadenas cortas.
| Indicador bacteriano fecal | Medios recomendados (Temperatura de incubación, tiempo) 1 |
| Coliformes totales | LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24 h) Medio M-Endo (35 ± 5 ° C, 24 h) |
| Coliformes fecales | Medio m-FC (44,5 ± 0,2 ° C, 24 h) |
| Enterococos fecales | m. enterococos Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h) |
Tabla 1. Medios de crecimiento de cultivo comúnmente utilizado para la detección de indicadores bacterianas fecales en muestras ambientales
1 según lo recomendado por los Métodos estándar para la examinación de agua y aguas residuales (American Asssociation de salud pública y la Asociación estadounidense de obras hídricas, 22nd edición, 2012)
Filtración de membrana y el posterior cultivo de las bacterias recogidas es una técnica útil para evaluar la calidad y limpieza de una fuente de agua.
La calidad del agua destinada para el uso en ajustes agrícolas, recreativas o domésticas es de gran importancia, debido al potencial de brotes de enfermedades transmitidas por el agua. Si el agua está contaminada con materia fecal de animales o seres humanos, y parásitos patógenos, bacterias o virus se pueden diseminar a nuevos anfitriones a su ingestión. Monitoreo de fuentes de agua para estos organismos causantes de enfermedades es fundamental para garantizar la salud pública.
El gran número y variedad de feco-oral patógenos que pueden estar presentes en una fuente de agua hace que sea práctico análisis de cada uno independientemente y de forma regular. Por el contrario, ensayos microbiológicos comunes sobre calidad del agua utilizan bacterias coliformes indicador. Para obtener más información sobre este proceso, ver vídeo de la colección de organismos indicadores.
Este video ilustra el proceso de filtración de membrana en una muestra de agua ambiental, muestran cómo varios tipos de bacterias fecales indicador incluyendo entercocci fecal, coliformes totales y coliformes fecales la cultura y describe cómo verificar la presencia de contaminación fecal.
Técnica de filtración de membrana utiliza presión negativa para extraer muestras de agua a través de un filtro y trampa de bacterias. El filtro es una membrana especializada con un tamaño de poro promedio mínima de 0,45 μm que permite la captura de las bacterias, que suelen ser alrededor de 1 μm en tamaño. Después de la filtración, la membrana es aplicada a los medios de crecimiento de agarosa y se incubaron en condiciones adecuadas a la cultura de los microorganismos objetivo.
Esta técnica es ideal para fuentes de baja turbidez como agua potable, piscinas o lagos y embalses. Alto contenido de partículas de agua puede resultar en ensuciar u obstrucción del filtro, limitando el volumen que pueda ser procesado. Además, la filtración de membrana no es práctica para fuentes de agua que contiene gran cantidad de antecedentes, o bacterias no coliformes, como aguas residuales, como esto puede aumentar la dificultad de enumerar coliformes blanco sobre cultura e incubación.
Una vez que las muestras bacterianas han sido atrapadas en el filtro, que pueden ser transferidas a placas de crecimiento para determinar los tipos de indicador bacterias presentes en las muestras de agua. Placas en diferentes tipos de medios selecciona para diferentes tipos de bacterianos y pueden permitir la identificación rápida.
Luego de un crecimiento en las placas específicas de cultura, más confirmación de las identidades de las bacterias del indicador puede realizarse mediante técnicas como la selección de colonias en medios líquidos y usando tubos Durham para capturar gases que deben ser producidos solamente en presencia de coliformes fecales, coliformes totales. Además, enterococos fecales sospecha pueden confirmarse mediante una combinación de una tinción de Gram positiva, junto con una prueba de peróxido de hidrógeno-catalasa negativo.
Ahora que estamos familiarizados con los principios de la filtración de membrana de las muestras de agua, vamos a echar un vistazo a cómo se realiza este procedimiento.
Para comenzar el procedimiento, primero recoger muestras de agua de fuentes de agua de prueba de interés. Asegúrese de que las muestras son recolectadas en botellas estériles de 1 L. Una vez completada la colección, poner las muestras en hielo y transportar al laboratorio para su análisis microbiano.
Para comenzar el análisis, primero se deben esterilizar un múltiple de la filtración de membrana. A continuación, conecte el múltiple a una bomba de vacío y frasco residuos de filtración que contenga blanqueador.
El etanol llama-esterilizar pinzas y extraer una membrana cuadriculada estéril del embalaje. Coloque el filtro en el centro de la zona de filtración de membrana de los colectores y aplica un embudo de filtro estéril a la unidad, luego asegúrelo en su lugar.
Medir un volumen de prueba de agua en el embudo. Aplicar un vacío parcial para sacar la muestra a través del filtro. Material sólido en suspensión, como materia orgánica, mayor que 0.45 μm será atrapados en o dentro del filtro, mientras que las partículas más pequeñas, virus, bacterias y sólidos disueltos se pase aunque en la cubeta de residuos que contienen cloro.
Después de que la muestra ha pasado por el filtro, lave el interior del embudo con 25 mL de agua estéril 3 veces, permitiendo que esto pase a través del filtro. Al terminar el enjuague final, desconecte la aspiradora y quitar el embudo de los colectores.
A continuación, etanol llama-esterilizar pinzas y retire inmediatamente el filtro de membrana de la unidad. Coloque sobre la placa de crecimiento apropiado para el microorganismo objetivo usando un movimiento de balanceo para asegurar el contacto completo con la superficie y evitar atrapar burbujas de aire.
Para el procesamiento de cada muestra adicional, desinfecte el colector de acero inoxidable y use un embudo estéril para evitar la contaminación cruzada. Por último, coloque las placas en una incubadora durante el período de incubación apropiado.
Tras el período de incubación, quitar las placas de la incubadora para la enumeración. Si es posible, realizar los recuentos de colonias bajo ampliación de baja potencia utilizando una fuente de luz blanca fría. Para determinar coliformes totales, identificar y contar las colonias que aparecen rosado a rojo oscuro en color y tienen un brillo metálico de superficie total o parcialmente sobre la Colonia. Las colonias atípicas de coliformes totales pueden aparecer mucoide, rojo oscuro o nucleadas sin brillo.
Las colonias que aparecen en azul, blanco, incoloro o rosa sin brillo se consideran no coliformes y no deben incluirse en el recuento de coliformes totales.
Colonias de coliformes fecales aparecerá como distintos tonos de azul, y estos deben ser contados como una categoría separada. Colonias de coliformes fecales no son típicamente de color gris a crema en color y también deberían registrarse en una categoría individual. Finalmente, las colonias de enterococos fecales que van desde rosa a rojo oscuro en color y deben contarse por separado.
Para comprobar las colonias de coliformes totales, aplicar un asa de inoculación esterilizado y enfriado a una sola Colonia de interés. Transferir la Colonia seleccionada en un recipiente de vidrio que contenga caldo de triptosa de laurilo y un tubo de Durham. A continuación, coloque las culturas en una incubadora. La presencia de turbidez con producción de gas por el tubo de Durham verifica a la Colonia como un coliforme total.
Para la verificación de coliforme fecal, transferir asépticamente colonias de color azules en los recipientes de vidrio que contiene el medio estéril CE y un tubo de Durham. Colocar los tubos inoculados en una incubadora. Después de la incubación, turbio inocula junto con gas producción confirman la colonia que un coliforme fecal.
Para confirmar los enterococos fecales, asépticamente transferir las colonias sospechosas con la morfología correcta sobre placas de Agar infusión de cerebro corazón e incubar. A continuación, transferir crecimiento de una colonia aislada en BHIA sobre dos portaobjetos estériles.
Añadir 2-3 gotas de peróxido de hidrógeno 3% a una de las diapositivas de cristal. Producción de gas rápido indica una bacteria catalasa-positivos tales como Citrobacter. Las bacterias enterococos fecales son catalasa negativa; por lo tanto, no se observa burbujear. Para colonias catalasa negativo que no aparecen burbujas, realizar una tinción de Gram. Enterococos fecales, estos deben aparecen Gram positivo, ovoide en forma y ser en su mayoría agrupadas en pares o corta cadenas.
Encontrar cualquiera de estas bacterias del indicador en una fuente de agua indica la presencia de una contaminación. Si más del 5% de las muestras se encuentran contaminados durante un período de un mes, la fuente se considere impropia para el consumo humano.
Filtración de membrana se utiliza comúnmente en un número de usos biológicos, y organismos indicadores fecales también pueden ser detectados por otros procedimientos experimentales. Algunas de estas aplicaciones son exploradas aquí.
Filtración de membrana puede utilizarse también en la captura de virus de muestras de agua. Como virus por lo general estará presentes en niveles muy bajos, las muestras de agua deben concentradas para captar para el análisis. Virus capturados pueden soltarse de los filtros e identificaron usando técnicas tales como ensayos de infectividad de cultura celular o PCR.
Filtración de membrana se utiliza también en la producción de agua de alta pureza para uso industrial o de laboratorio. Muchas industrias requieren agua altamente purificada para sus procesos operativos, y la filtración de membrana puede servir para eliminar contaminantes como los metales disueltos no deseados y sales del agua. También puede ser utilizado en la desalinización de agua salada para producir agua potable.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la identificación de organismos indicadores en agua por filtración de membrana. Ahora usted debe entender cómo las muestras de agua de filtro de membrana, cómo cultivar varios tipos de bacterias fecales indicador de la membrana y cómo confirmar éstos como organismos indicadores. ¡Gracias por ver!
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Applications and Summary
Filtración de membrana se utiliza en concentración de agua y captura de virus. Virus patógenos humanos llevan una carga negativa neta en soluciones acuáticas y a menudo están presentes en niveles bajos en las fuentes de agua. Por lo tanto deben ser concentradas antes del análisis. Filtración de membrana no es más que una captura método para ello y emplea un filtro cargado negativamente. Las muestras de agua (por ejemplo, 1 L) de interés se modifican con una solución de sal (ej. cloruro de magnesio) para impartir una carga positiva a los virus, facilitando así su absorción en el filtro de membrana HA cargado negativamente como se filtra el agua. Una solución de baja concentración de ácido se utiliza para enjuagar la membrana y deshacerse del exceso de sales. Una baja concentración y el volumen de hidróxido de sodio se utiliza entonces para liberar el virus del filtro antes de otros análisis (por ejemplo célula cultura ensayos de infectividad o PCR cuantitativa) y concentraciones.
Filtración de membrana se utiliza también en la producción de agua de proceso de alta pureza para uso industrial. Muchas industrias requieren de agua altamente purificada para sus procesos operativos. Filtración de membrana (por ejemplo, nano-filtración) sirve para eliminar los contaminantes incluyendo metales disueltos y sales del agua. Filtración de membrana se utiliza también en la desalación de agua salada para producir agua potable.
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