Overview
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Luisa Ikner
Métodos tradicionales de análisis de comunidades microbianas en suelos generalmente han implicado o ensayos culturales utilizando la dilución y metodología en medios selectivos y diferenciales o ensayos de recuento directo de la galjanoplastia. Conteo directo ofrece información sobre el número total de bacterias presentes, pero ninguna información sobre el número o la diversidad de las poblaciones presentes en la comunidad. Cuenta de placa permite enumeración total cultural o las poblaciones culturales y por lo tanto, proporciona información sobre las diferentes poblaciones presentes. Sin embargo, dado que menos del 1% de bacterias del suelo son fácilmente cultivable, información cultural ofrece sólo un pedazo de la imagen. La fracción real de la comunidad que puede ser cultivada depende el medio elegido para cuentas culturales. Selecciona cualquier medio solo para las poblaciones que mejor se adapten a ese medio particular.
En los últimos años han puesto de manifiesto las ventajas de estudiar la comunidad ADN extraído de muestras de suelo. Este enfoque basado en el nonculture se piensa para ser más representativo de la comunidad real presente que los enfoques basados en la cultura. Además de proporcionar información sobre los tipos de poblaciones presentes, este enfoque también puede proporcionar información acerca de su potencial genético. Como con cualquier técnica, existen limitaciones a los datos que pueden obtenerse con la extracción de ADN. Por lo tanto, muchos investigadores ahora utilizan la extracción de ADN junto con cuenta directa y cultural para aprovechar al máximo los datos obtenidos de una muestra ambiental.
Principles
Extracción de ADN de suelo puede realizarse de dos maneras diferentes (tabla 1). En el método en situ , se utiliza una combinación de técnicas químicas y mecánicas. Para esta extracción, una masa de suelo se combina con un volumen equivalente de un tampón de extracción. Granos de cristal se añaden a la suspensión junto con un volumen de detergente (dodecil sulfato de sodio, o SDS, se utiliza normalmente), y la muestra se mezcla para facilitar la separación de las partículas del suelo seguida de incubación a una temperatura elevada para promover la lisis celular. Después de la centrifugación, el sobrenadante se somete a otros pasos de incubación y extracción para purificar el producto de la DNA.
Alternativamente, las células puede ser fraccionadas (o separadas) de la matriz del suelo antes de la extracción del material genético. Una masa de muestra de suelo somete a ciclos sucesivos de la mezcla y lento centrifugación. El paso de la paliza del grano se elimina, sin embargo, para mantener las células intactas, que se centrifugaron para obtener un pellet. Una extracción de lisozima se realiza en conjunto con incubación para desarticular las paredes celulares y liberar el DNA para purificación.
Este manuscrito y video demostrará el situ método de extracción de ADN de suelo, como este procedimiento se ha demostrado para producir mayores concentraciones de ADN de muestras de suelo en relación con el método de fraccionamiento celular.
| Tema | Fraccionamiento bacteriana | In Situ Lisis de |
| Rendimiento de ADN | 1-5 μg/g | 1-20 μg/g |
| Representante de la comunidad | Menos representante debido a absorción celular | Absorción celular más representativo, |
| Fuente de ADN recuperado | Solamente las bacterias | Sobre todo las bacterias sino también hongos y protozoos |
| Grado de corte del ADN | Menos de corte | Más de corte |
| Tamaño medio de los fragmentos de ADN | 50 kb | 25 kb |
| Grado de contaminación húmica | Menos contaminados | Más contaminados |
| Facilidad de metodología | Baja, laborioso | Más rápido, requiere menos mano de obra |
Tabla 1. Comparación de metodologías de lisis bacterianas de la fraccionamiento y en situ para la recuperación de ADN de suelo.
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Procedure
1. bacteriana comunitaria la extracción de ADN
- Para comenzar el procedimiento, pesar 100 g de suelo tamizado. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y añadir 100 mL de tampón de extracción compuesta por Tris buffer modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agitar a mano.
- A continuación, pesar 100 g de perlas de vidrio y agregar al recipiente de mezcla. Agitar la muestra durante 5 min mediante una tira a dispositivo o agitador de muñeca-acción mecánica para 15 minutos agregar 10 mL 20% sodio dodecil sulfato, o SDS, a la mezcla, luego agitar durante un minuto adicional. Incubar a una temperatura elevada de 60-65 ° C durante 60 minutos.
- Igualmente distribuir la muestra entre los diferentes tubos de 50 mL y centrifugar 10 min a 6.000 x g. transferir el sobrenadante de los tubos a un único contenedor estéril. A continuación, repetir la extracción en el sedimento del suelo como se describió anteriormente, utilizando un nuevo volumen de tampón de extracción.
- A continuación, añadir el volumen de sobrenadante transformado, aproximadamente 200 mL a un tubo de 50 mL limpio llenado a mitad de volumen con una solución 30% glicol de polietileno y 1,6 M de cloruro de sodio. Invertir las botellas varias veces con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. muestras de centrifugar a 10.000 x g por 20 min a la pelotilla de la DNA.
- Retire el sobrenadante con cuidado el tubo de centrífuga, dejando atrás el pellet de ácidos nucleicos parcialmente purificada. Añadir 20 mL de Buffer TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7.5 M para Resuspender el precipitado, entonces el vórtice. Coloque la suspensión en hielo por 5 min centrifugar a 16.000 x g durante 30 min a 4 ° C para precipitar las proteínas y los polisacáridos.
- A continuación, agregue una RNasa y proteinasa K a la muestra, mezclar suavemente con la mano y dejar reposar para el momento. Añadir un volumen equivalente de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (mezcla de proporción de 25:24:1) a la suspensión para extraer y mezclar suavemente con la mano. Centrifugar la preparación durante 10 minutos a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y nota las dos capas.
- La parte inferior, la capa más pesada se compone de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico y extrae desechos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Colocar la fase acuosa en un recipiente estéril, agregar un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación de ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. pelotilla de la DNA purificada por centrifugación a 16.000 x g por 30 minutos Retire con cuidado el sobrenadante como ADN concentrado puede o puede no ser visible en la parte inferior de la nave y luego resuspender en 1 mL de tampón TE.
- Utilizando un espectrofotómetro o un Fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, medir el nivel de la DNA extraída de la muestra. Se estima la cantidad de ADN de la lectura de nm 260. Una lectura de absorbancia de 1.0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solución. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluir la suspensión de 1 a 10, o 1 a 100 con agua de grado molecular.
- La pureza del ADN se calcula la relación de la lectura a 260 nm que a 280 nm. Un valor > 1,7 indica que relativamente puro ADN. El valor teórico máximo es 2.0.
Comunidad bacteriana la extracción de ADN es un proceso por el cual ADN se obtiene de varias especies bacterianas dentro de una comunidad durante un procedimiento de extracción solo.
Análisis tradicionales de las comunidades microbianas en el suelo generalmente han implicado ensayos culturales, utilizando la dilución y galjanoplastia metodología en diferentes medios selectivos. Sin embargo, muchas bacterias crecen mal en condiciones de laboratorio o en las específicas medios condiciones de crecimiento seleccionadas, significando pueden ser perdidas o seriamente subrepresentados.
Recientemente, ha permitido extraer ADN de comunidad de muestras bacterianas del suelo para un muestreo más amplio de comunidades bacterianas. Este enfoque basado en la cultura no es probablemente más representativa de las comunidades reales presentes que métodos basados en la cultura tradicional.
Este video muestran un método no-cultura de la comunidad bacteriana la extracción de ADN, cómo comprobar la calidad y cantidad de ADN extraído y explorar cómo este ADN puede utilizarse para estudiar la diversidad bacteriana.
Extracción de ADN de suelo puede realizarse de dos maneras. En el método de fraccionamiento, las células se separan primero de la matriz del suelo antes de la extracción del material genético. La muestra entonces se somete a ciclos sucesivos de la mezcla y lento centrifugación para recoger las células intactas en un pellet.
Lisozimas se añaden a las células, y la suspensión se incuba. Lisozimas son enzimas que degradan las paredes celulares bacterianas. Una vez que se ha comprometido la estructura de la pared celular, el ADN puede entonces liberarse para la purificación. Sin embargo, un segundo método de comunidad de extracción de ADN, el método en situ , se ha demostrado para producir una mayor concentración de ADN.
Aquí, una masa de suelo se combina con un volumen equivalente de buffer de extracción Tris-EDTA y perlas de vidrio y agresivamente para facilitar la separación de las células de las partículas del suelo. Luego se añade un detergente, generalmente dodecil sulfato de sodio, o SDS y la muestra se mezcla aún más para promover la lisis de las células y la liberación de su contenido, incluyendo el ADN.
Incubación a una temperatura alta se realiza entonces a lyse las células bacterianas restantes. Las muestras son centrifugadas y una extracción de glicol de polietileno y la incubación se realiza en el sobrenadante para precipitar el ADN, que luego se centrifuga en un pellet.
El ADN se resuspendió en Buffer TE acetato de potasio para lavar el ADN de las proteínas y polisacáridos, y centrifugación se lleva a cabo a estos componentes indeseables de la pelotilla. El sobrenadante acuoso que contiene el ADN se extrae y sometido a una precipitación de extracción y isopropanol de fenol-cloroformo más limpio y concentrar el ADN. Después de un período de incubación de temperatura de dos horas, el ADN se centrifugó y resuspendió en Buffer TE para el almacenamiento hasta su análisis.
Ahora que estamos familiarizados con los conceptos y procesos detrás de comunidad bacteriana la extracción de ADN, echemos un vistazo a cómo se realiza en el laboratorio.
Para comenzar el procedimiento, pesar 100 g de suelo tamizado. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y añadir 100 mL de tampón de extracción compuesta por Tris buffer modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agitar a mano.
A continuación, pesar 100 g de perlas de vidrio y agregar al recipiente de mezcla. Agitar la muestra durante 5 min mediante una tira a dispositivo o agitador de muñeca-acción mecánica. Añadir 10 mL 20% sodio dodecil sulfato, o SDS, a la mezcla y agite por un minuto adicional. Incubar a una temperatura alta durante 60 minutos.
Igualmente distribuir la muestra entre tubos separados 50 mL y centrifugar 10 min a 6.000 x g. transferir el sobrenadante de los tubos a un único contenedor estéril. A continuación, repetir la extracción en el sedimento del suelo como se describió anteriormente, utilizando un nuevo volumen de tampón de extracción.
A continuación, añadir el volumen total de procesados sobrenadante a un tubo de 50 mL limpio llenado a mitad de volumen con una solución 30% glicol de polietileno y 1,6 M de cloruro de sodio. Invertir las botellas varias veces con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. muestras de centrifugar a 10.000 x g por 20 min a la pelotilla de la DNA.
Retire el sobrenadante con cuidado el tubo de centrífuga, dejando atrás el pellet de ácidos nucleicos parcialmente purificada. Añadir 20 mL de Buffer TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7.5 M para Resuspender el precipitado, entonces el vórtice. Coloque la suspensión en hielo por 5 min centrifugar a 16.000 x g durante 30 min a 4 ° C para precipitar las proteínas y los polisacáridos.
A continuación, agregue una RNasa y proteinasa K a la muestra, mezclar suavemente con la mano y dejar reposar para el momento. Añadir un volumen equivalente de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico a la suspensión para extraer y mezclar suavemente con la mano. Centrifugar la preparación durante 10 minutos a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y nota las dos capas.
La parte inferior, la capa más pesada se compone de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico y extrae desechos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Colocar la fase acuosa en un recipiente estéril, agregar un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación de ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. pelotilla de la DNA purificada por centrifugación a 16.000 x g por 30 minutos Retire con cuidado el sobrenadante como ADN concentrado puede o puede no ser visible en la parte inferior de la nave y luego resuspender en 1 mL de tampón TE.
Utilizando un espectrofotómetro o un Fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, medir el nivel de la DNA extraída de la muestra. Fluorimeters de ADN/ARN dará salida a los niveles de ADN en unidades de nanogramos por mililitro. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluir la suspensión de 1 a 10, o 1 a 100 con agua de grado molecular.
Una vez que el ADN se obtiene de una comunidad bacteriana, este puede ser utilizado en un número de maneras diferentes. Algunas de esas aplicaciones son exploradas aquí.
Spectrophotographic análisis de la DNA extraído de comunidad ADN pueden proporcionar una penetración en el número de células bacterianas presentes en una muestra de suelo dado. Puede relacionar con la cantidad estimada de ADN en ng por mL de solución en el volumen total del ADN extraído en solución, para dar la cantidad total de ADN por g de suelo. Conocer el valor teórico de ADN por célula, se puede calcular el número total de células por g de suelo.
Para más usos, apuntados la DNA extraída de comunidades bacterianas puede ser sometida a la PCR para determinar si una especie en particular está presente dentro de la comunidad. Por ejemplo, los científicos puede identificar si las muestras de suelo contienen patógenos específicos, tales como Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.
Finalmente, para obtener una comprensión más completa de las bacterias presentes en una comunidad, muestras de ADN pueden ser sometidas a la caracterización "omic" y bioinformáticas que permitan análisis más profundo de la bacteria original dentro de la muestra. "Ómicas" describen una gama de tecnologías que explorar roles, relaciones y acciones de las moléculas en los organismos o comunidades. Esto incluye los estudios de genes y su función, o "Genómica" y "Proteómica", el estudio de proteínas y sus funciones. Por ejemplo, secuenciación del ARN 16S de las muestras puede permitir una determinación de metagenómica de especie específica dentro de la comunidad, dando una estimación más detallada de la diversidad. Este enfoque puede dar a los científicos una mejor comprensión de la composición de especies de una comunidad, y qué funciones pueden realizar.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a comunidad bacteriana la extracción de ADN. Ahora debería entender cómo extraer ADN de una comunidad bacteriana, cómo comprobar la calidad de este ADN, y cómo este DNA puede ser utilizado para las investigaciones de la composición de la comunidad bacteriana. ¡Gracias por ver!
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Applications and Summary
Comunidad ADN de cultivo colonias o extraídos de suelo puede ser sometido a enfoques de la Bioinformática y la "omic" que permiten la caracterización de la bacteria original dentro de la muestra. Los omic los acercamientos incluyen metagenómica – determinación de "que" está dentro de la comunidad a través de rRNA 16S que ordena. Esto da una estimación de la diversidad dentro de la comunidad.
También se puede calcular el número de células bacterianas en la muestra de suelo original. Comunidad ADN es extraído de un suelo y cuantificado por análisis espectroscópico. Está relacionado con la cantidad estimada de DNA medida μg de DNA por mL de solución en el volumen total del ADN extraído en solución para dar una cantidad total de ADN por g de suelo. Al conocer el valor teórico de ADN por célula, se puede calcular el número total de células por g de suelo.
Ejemplo
Un suelo tiene 0.12 μg ADN por g de suelo
Si cada celda tiene 4 fg de ADN
El ADN extraído de comunidad puede ser sometido a análisis de la polimerización en cadena usando las cartillas específicas para determinar si una especie en particular está presente dentro de la comunidad. Los ejemplos incluyen específicas bacterias patógenas como Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.
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