Extraktion von DNA aus Bakterienkolonien

Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion ist ein Prozess, der durch den DNA aus mehrere Bakterienarten innerhalb einer Gemeinschaft während einer einzigen Extraktionsverfahren gewonnen wird.

Traditionelle Analysen von mikrobiellen Gemeinschaften im Boden haben in der Regel kulturelle Assays, Verwendung von Verdünnung und Plattieren Methodik auf verschiedenen Selektivmedien beteiligt. Viele Bakterien wachsen jedoch schlecht unter Laborbedingungen oder auf die spezifischen Medien Wachstumsbedingungen ausgewählt, d. h. sie können verpasst oder stark unterrepräsentiert.

Vor kurzem hat die Gemeinschaft DNA Extraktion aus bakteriellen Bodenproben für eine umfassendere Auswahl von Bakteriengemeinschaften erlaubt. Dieser Ansatz nicht-Kultur gilt als repräsentativ für die tatsächliche Gemeinschaften als traditioneller Kultur Methoden basieren.

Dieses Video zeigt eine nicht-Kultur-Methode der Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, gewusst wie: überprüfen die Qualität und Quantität der extrahierten DNA, und entdecken, wie diese DNA genutzt werden kann, um bakterielle Vielfalt untersuchen.

DNA-Extraktion aus dem Boden kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Bei der Fraktionierung-Methode werden zunächst Zellen aus der Bodenmatrix vor der Extraktion des genetischen Materials getrennt. Die Probe unterliegt dann aufeinander folgenden Zyklen von mischen und langsam Zentrifugation um intakte Zellen in einem Pellet zu sammeln.

Lysozymes werden dann zu den Zellen, und die Federung inkubiert. Lysozymes sind Enzyme, die bakteriellen Zellwände. Sobald die Zellwandstruktur kompromittiert wurde, kann die DNA dann zur Reinigung befreit. Eine zweite Methode der Gemeinschaft DNA-Extraktion, die in Situ -Methode hat jedoch gezeigt worden, um größere DNA-Konzentration zu erzielen.

Hier ist eine Masse des Bodens mit gleichwertigem Umfang der Tris-EDTA Extraktionspuffer und Glasperlen, kombiniert und gemischte aggressiv, Trennung der Zellen von der Erde-Teilchen zu erleichtern. Ein Waschmittel wird dann hinzugefügt, in der Regel Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS und der Probe wird weiter zur Förderung der Lyse der Zellen und Veröffentlichung ihrer Inhalte, einschließlich DNA gemischt.

Inkubation bei hoher Temperatur ist dann verpflichtet, alle übrigen bakteriellen Zellen lysiert. Proben zentrifugiert, und ein Polyethylenglykol-Extraktion und Inkubation erfolgt auf den Überstand um überstürzen sich die DNA, die dann in einem Pellet zentrifugiert wird.

Die DNA ist in TE-Puffer Nukleinsäuretablette und Kalium Acetat um weiter Waschen der DNS Proteine und Polysaccharide, dann Zentrifugation wird durchgeführt, um diese unerwünschten Bestandteilen pellet. Der wässrige überstand mit der DNA wird entfernt und eine Phenol-Chloroform Extraktion und Isopropanol Niederschlag, sauber weiter und konzentrieren sich die DNA ausgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden Zimmertemperatur ist die DNA zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in TE-Puffer für die Lagerung bis zur Analyse.

Jetzt sind wir vertraut mit den Konzepten und Prozessen hinter Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, werfen Sie einen Blick an, wie es im Labor durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.

Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Schütteln Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker. 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, zu der Mischung hinzufügen, dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur für 60 min inkubieren.

Die Probe unter separaten 50 mL Röhrchen gleichmäßig zu verteilen, und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand von den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.

Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.

Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.

Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.

Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.

Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. DNA/RNA Fluorimeters Ausgang wird DNA-Ebenen in Einheiten von Nanogramm pro Milliliter. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.

Das gewonnene DNA aus einer Bakteriengemeinschaft ist, kann dies in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten genutzt werden. Einige dieser Anwendungen werden hier untersucht.

Spectrophotographic Analysen der DNA extrahiert aus DNA-Community bieten einen Einblick in die Anzahl der bakteriellen Zellen in einem bestimmten Bodenprobe. Die geschätzte Menge der DNA in ng pro mL Lösung kann auf das Gesamtvolumen der DNA extrahiert in Lösung, um den Gesamtbetrag der DNA pro g des Bodens geben zurückzuführen. Wissen um den theoretischen Wert von DNA pro Zelle, kann die Gesamtzahl der Zellen pro g Boden berechnet werden.

Weitere gezielte Anwendungen von Bakteriengemeinschaften extrahierte DNA PCR um festzustellen, ob eine bestimmte Sorte innerhalb der Gemeinschaft vorhanden ist unterworfen werden kann. Wissenschaftler können z. B. ermitteln, ob Bodenproben spezifische Krankheitserreger, wie Clostridium Perfringens oder Bacillus Anthracisenthalten.

Zu guter Letzt können um ein umfassenderes Verständnis von Bakterien in einer Gemeinschaft zu erhalten, DNA-Proben ausgesetzt werden "Omic" und bioinformatische Charakterisierung, die eine tiefer gehende Analyse der ursprünglichen Bakterien in der Probe ermöglichen. "Omics" beschreibt eine Reihe von Technologien, die Rollen, Beziehungen und Aktionen von Molekülen in Organismen oder Gemeinden zu erkunden. Dazu gehören die Studien der Gene und ihrer Funktion oder "Genomik", und "Proteomics", die Untersuchung von Proteinen und ihre Rollen. Sequenzierung der 16 s RNA aus Proben kann beispielsweise eine metagenomische Bestimmung der spezifischen Arten innerhalb der Gemeinschaft, so dass eine genauere Schätzung der Vielfalt zulassen. Dieser Ansatz kann geben Wissenschaftler ein besseres Verständnis für die Spezies Make-up einer Gemeinschaft, und welche Rolle können sie Unternehmen.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion. Sie sollten jetzt verstehen, wie zum Extrahieren von DNA aus einer bakteriellen Gemeinschaft, wie Sie die Qualität dieser DNA und wie diese DNA für Untersuchungen der Bakteriengemeinschaft Komposition verwendet werden kann. Danke fürs Zuschauen!