Overview
Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Das Ziel vieler chemischer Analysen ist eine Quantitative Analyse, wo die Menge einer Substanz in einer Probe bestimmt. Um die Konzentration eines unbekannten aus einer Stichprobe genau zu berechnen, ist die sorgfältige Probenvorbereitung Schlüssel. Jedes Mal, wenn eine Probe verarbeitet oder übertragen wird, können einige der Probe verloren gehen. Allerdings gibt es Strategien zur Minimierung der Probenverlust. Es gibt auch Strategien zur Bewältigung der Probenverlust und noch genaue Messungen der Konzentration.
Zur Minimierung von Probenverlust ist Ideal um die Anzahl der Beispielschritte Handhabung und Übertragung zu minimieren. Beispielsweise reduziert die Massierung von einer festen Probe direkt in eine Flasche, der eine Lösung erzielt werden einen Transfer-Schritt. Wenn es notwendig, aus einer Flasche auf einen anderen übertragen und eine Verdünnung erfolgt, hilft dreifach spülen der Gläser, sicherzustellen, dass die Probe übertragen wird. Andere Strategien sind spezifischer auf die Probe. Proben, die auf Glas, wie zum Beispiel Proteine, adsorbieren könnte beispielsweise besser in Einweg-Polypropylenröhrchen gehandhabt werden. Die Rohre sind nicht hydrophil, also wenn eine kleine Menge der Probe in Wasser pipettiert werden wird, es empfiehlt sich, bereits hinzugefügt haben, das Wasser mit dem Schlauch direkt in das Lösungsmittel die Probe pipettiert werden kann. Es möglicherweise besser zu konzentrieren, anstatt eine Probe durch Verluste aus Insolubilities nach Rehydratation vollständig trocknen.
Eine weitere Quelle von Probenverlust ist durch unvollständige Probe Manipulationen. Beispielsweise wird wenn eine Derivatisierung Verfahren verwendet wird und die Derivatisierung unvollständig ist, dann der volle Betrag der Probe nicht beobachtet. Fehler wie diese sind systematische Fehler und Behebung des Problems, wie das Ändern der Derivatisierung Verfahren gelöst werden können. Eine weitere Ursache für systematische Fehler bei Messungen ist Matrix-Effekte. Diese können Messung bestimmter Stoffe und darstellende Kalibrierungen in der gleichen Matrix stören, da die Probe kann diesen Effekt reduzieren.
Quantitative Analyse wird in der Regel mit entweder extern oder intern Standards durchgeführt. Für externe Standards erfolgt eine Kalibrierkurve durch Messung unterschiedliche bekannteste Konzentration des Analyten von Interesse. Dann ist das Beispiel separat vom Standard ausgeführt. Für interne Standards ist der Standard in der gleichen Probe als der Analyten von Interesse, so dass die Messung gleichzeitig entnommen werden. In der Regel einer anderen Spezies wird hinzugefügt, dass interne Standard des internen Standards und das Verhältnis der Antwort gefordert und der Analyt wird berechnet. Die Idee ist, dass das Verhältnis der Reaktion, genannt der Responsefaktor proportional zu ihrer Konzentration. Während die Methode der Analyten von Interesse und dem internen Standard unterscheiden kann muss, sollte jede Probe-Verluste, die auftreten, nachdem der interne Standard hinzugefügt wird für beide Substanzen ähnlich und somit das Verhältnis der Antwort bleibt die gleiche. Ein besonderer Fall der Verwendung von internen Standards ist die Methode der Standardzusätzen, wo immer größere Mengen des Analyten wird der Projektmappe hinzugefügt und der Ursprungsbetrag des Analyten zurück berechnet. Interne Standards können in der Chromatographie, Elektrochemie und Spektroskopie verwendet werden.
Principles
Interner Standard ist eine Substanz, die in einen konstanten Betrag hinzugefügt, um eine Probe, leer und standard in einer Analyse. Interner Standard kann systematische und zufällige Fehler ausgleichen. Beispielsweise gibt es Instrument Schwankungen, die zufälligen Fehler bei der Messung führen, diese Schwankungen werden voraussichtlich für die internen Standards und den Analyten gleich und somit ändert sich das Verhältnis von Signalen nicht. Für systematische Fehler, wie Matrix-Effekte des Lösungsmittels solange der Effekt für den Standard und die Analyten, gleich ist, ist das Verhältnis wieder unberührt.
Der Nachteil von internen Standards ist, dass es schwer ist, einen geeigneten internen Standard zu finden. Des internen Standards muss ein Signal sein, ist der Analyt ähnlich, aber unterschiedlich genug, dass es durch das Instrument zu unterscheiden. Des internen Standards sollten auch nicht in der Probenmatrix vorhanden sein, damit die zusätzliche Standard die einzige Quelle des Standards ist. Gelegentlich ein Hauptbestandteil einer Probe, die konstante Konzentration ist einsetzbar als interner Standard anstelle einer zusätzlichen Standard, aber die Konzentration für diesen Bestandteil bekannt sein muss. Des internen Standards sollte auch nicht unterdrücken oder das Signal des Analyten verbessern.
Chromatographie ist eines der größten Fehlerquellen oft die Injektion. Wenn manuelle Injektionen verwendet werden, können Fehler in der Spritze ordnungsgemäß geladen. Bände sind in der Regel klein (~ 1 µL) so gibt es Unsicherheiten in reproduzierbar Injektion dieses kleine ein Volumen, oft ein paar Prozent relative Standardabweichung (RSD). Gaschromatographie (GC) die Probe wird in einen beheizten Port injiziert und Verdampfung von der Nadelspitze kann dazu führen, dass Abweichungen in Volumen injiziert. Auto-Sampler mit dem Fehler beim Laden von der Spritze und der Fehler bei injizierenden schnell Verdunstung im GC vermeiden helfen kann, aber des Fehlers noch 1 – 2 % RSD. Mit Chromatographie dient Peakfläche in der Regel statt Peakhöhe, wie die Gipfel breiter und kürzer mit der Zeit aber die Peakfläche konstant ist. So, für interne Standards Verhältnisse der Peakflächen in Chromatographie statt Gipfel Höhen eingesetzt.
Für eine Kalibrierung mit einem internen Standard wird ein Antwort-Faktor berechnet. Der Responsefaktor (R) ist das Verhältnis von den Gipfeln im Vergleich zu dem Verhältnis der Konzentrationen, wobei X der Analyten und IS ist, der interne Standard ist.
Für den Bereich Chromatographie (A) genutzt wird. Der Responsefaktor kann berechnet werden, aus einer Kalibrierung Handlung von einerX/aIS Vs CX/cIS, wo der Responsefaktor ist die Steigung und y-Achsenabschnitt ist als 0 angenommen. Sobald der Responsefaktor Standards bekannt ist, kann die Reaktion des unbekannten aus dem gemessenen Bereichsverhältnis aus dem Experiment berechnet werden.
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Procedure
1. richtige Probenbehandlung: Bildet eine Lösung
- Nehmen Sie ein sauberes Becherglas und Masse die richtige Menge der Probe hinein. Notieren Sie die tatsächliche Masse verwendet. In diesem Beispiel wird eine Lösung von Adenin in einem volumetrischen Kolben für den Einsatz als interner Standard für die nächste Analyse gemacht. Die Masse von Adenin ist 100 mg. Tun nicht direkt in einem volumetrischen Kolben Masse, denn es einen langen Hals hat und die Adenin kann nicht leicht hinzugefügt oder entfernt.
- Fügen Sie etwa 25 mL des Lösungsmittels (in diesem Fall Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) in die Becher und lassen es rühren, sich aufzulösen. In diesem Beispiel die endgültige Lösung erfolgt in einem 50 mL volumetrischen Kolben, also nur ca. 25 mL, so dass der Becher gespült werden kann und die Lösung auf das Endvolumen hinzufügen.
- Sobald die Solid aufgelöst hat, füllen Sie die Lösung in den volumetrischen Kolben.
- Spülen Sie den Becher und die Stir Bar mit geringen Mengen an Lösungsmittel, ca. 10 mL und gießen Sie die Spülung in die volumetrische Flasche. Zweimal wiederholen Sie mehr. Dadurch werden korrekte Lösung zu gewährleisten.
2. Vorbereitung des einen internen Standard Kalibrierkurve
- Bereiten Sie die gewünschten standard Proben für die Gaschromatographie Analyse. In diesem Beispiel Koffein aus Kaffee mit Acetonitril extrahiert und dann Adenin dient als interner Standard für die Messung.
- Für die Koffein-Proben die Menge der Probe benötigt, um 1 mg/mL Probe machen abwiegen. Wenn ein volumetrische 10-mL-Fläschchen, das heißt 10 mg.
- Wiegen Sie der Analyt in ein Becherglas, fügen Sie ein paar mL des Lösungsmittels (hier Methanol) auflösen, dann quantitativ in den volumetrischen Kolben mit 3 Spülungen übertragen.
- Machen Sie 3 weitere Standards in ähnlicher Weise mit 0,2, 0,5 bis 2 mg/mL Koffein.
- Genommen Sie 1 mL pro Koffein in ein Probengefäß standard.
- Jedes Probengefäß 0,2 mL 2 mg/mL Adenin interner Standard hinzufügen.
- Führen Sie das Gas-Chromatographie-Experiment mit jeder Koffein-Standard. Berechnen Sie dem Verhältnis der Peakflächen für Koffein Vs für jedes Chromatogramm des Standards.
- Machen Sie ein Grundstück von der Gegend Verhältnis Vs das Konzentration-Verhältnis. Die Neigung dieser Fläche ist der Responsefaktor.
3. Vorbereitung einer echten Probe mit internem Standard für die Gaschromatographie
- Bereiten Sie die gewünschte Probe für die Gaschromatographie-Analyse. In diesem Beispiel wird Koffein aus Kaffee mit Acetrontrile gewonnen.
- Für die Kaffee-Probe, Masse, 2 g Kaffee in einen 100-mL-Becherglas. Notieren Sie das exakte Gewicht des Kaffees.
- Den Becher 20 mL Acetonitril hinzufügen.
- Lassen Sie es 20 Minuten, unter häufigem Rühren zu sitzen.
- Filtern Sie den Kaffeesatz mit einem Filterpapier in einen Trichter.
- Spülen Sie den Filter Papier 3 X mit kleinen Mengen von Acetonitril (5 mL).
- Der letzte Band der das Filtrat zu messen. Es sollte etwa 35 mL.
4. führen Sie das Beispiel und berechnen die Konzentration zu
- Nehmen Sie 1 mL der Probe Kaffee Extrakt ein und 0,2 mL des internen Standards in einer Durchstechflasche. Legen Sie das Fläschchen in Auto-Sampler-Rack.
- Führen Sie eine GC-Analyse der Probe. Stellen Sie sicher, dass die GC-Bedingungen sind derart, dass das Koffein und Adenin zu trennen. In diesem Beispiel werden Isotherme Trennungen bei 200 ° c durchgeführt.
- Berechnen Sie nach der Analyse die Peakfläche für den internen standard Gipfel und den Analyten-Peak. Über ihre Verhältnisse, berechnen Sie die Menge des Koffeins in der Probe.
5. Ergebnisse: GC-Analyse von Koffein mit internem Standard
- GC-Analyse von Koffein ist in Abbildung 1dargestellt. Adenin ist als interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Peakflächen gemessen werden und gegen das Verhältnis der Konzentrationen aufgetragen. Die Neigung des Grundstücks ist der Responsefaktor (in diesem Fall 1,8).
- Abbildung 2 zeigt ein Chromatogramm einer Kaffee-Probe mit internem Standard Adenin. Das Verhältnis von Peak ist 1,78. Mit der Responsefaktor und bekannter Konzentration von Adenin (0,33 mg/mL), ist die Konzentration von Koffein in der unbekannten Probe berechnet 0,33 mg/mL.
Abbildung 1: Kalibrierung-Grundstück mit einem internen Standard. Eines Grundstücks die Verhältnisse Vs Konzentration Flächenverhältnisse für 3 Standardmuster von Koffein (1, 0,5 und 0,2 mg/mL) mit 0,33 mg/mL Adenin internem Standard der einzelnen hinzugefügt. Die Steigung der geraden ist 1.8, der Responsefaktor.
Abbildung 2: Chromatogramm des Kaffees mit internem Standard Adenin. Ein Grundstück von der Reaktion der FID-Detektor auf Proben. Die drei wichtigsten Gipfel sind Adenin (IS), Koffein und Palmitinsäure.
Probenverlust auftreten kann, jedes Mal, wenn eine Probe ist verarbeitet oder übertragen werden, wodurch genaue Berechnungen der Konzentration schwierig.
Um Genauigkeit zu gewährleisten, müssen die Auswirkungen der Probenverlust mit sorgfältigen Probenvorbereitung minimiert werden und durch beschränken der Anzahl der Beispielschritte Handling und Transfer. Probenverlust kann jedoch auch durch systematische Fehler, wie z. B. unvollständige Probe Manipulation, Matrix-Effekte und Variationen in analytischen Verfahren auftreten.
Diese Quellen des Verlustes können berücksichtigt werden durch Zugabe von ein bekannter Konzentration einer Art ähnlich aber nicht identisch, auf die Verbindung von Interesse. Dies nennt man einen internen Standard. Jede Probe Verluste an den internen Standard sollte ähnliche für den Analyten, zulassend die Konzentration genau berechnet werden.
Dieses Video wird die Verwendung einer internen standard und richtigen Labor Technik Probenverlust berücksichtigen bei der Festlegung der Konzentration eines unbekannten zu veranschaulichen.
Interner Standard ist eine Substanz, die in einer bekannten Menge Normen, Proben und Rohlinge während einer Analyse hinzugefügt.
Chromatographie und Spektroskopie ist das Verhältnis des Signals für den internen Standard und den Analyten berechnet. Dieses Verhältnis, genannt der Responsefaktor ist proportional zum Verhältnis des Analyten und standard-Konzentrationen.
Responsefaktor, R, kann durch die folgende Gleichung, wo ein stellt die analytische Signale der Probe und internen Standards und C stellt die Konzentrationen der Probe und internem Standard ausgedrückt werden.
Interner Standard kann systematische und zufällige Fehler ausgleichen. Z. B. zufällige Fehler – wie Inkonsistenzen bei der Messung einer Probe—das gleiche für den internen Standard und den Analyten. Daher wird das Verhältnis ihrer Signale nicht ändern.
Für systematische Fehler, wie Matrix-Effekte in Lösung wird das Verhältnis nicht betroffen sein, solange die Matrix-Effekt für den Standard und den Analyten entspricht.
Während interne Standards großen Nutzen bieten, kann es schwierig sein, eine wählen, die geeignet ist. Ein internes Standards muss ein Signal sein, ähnlich aber nicht identisch mit den Analyten ist. Es kann nicht auch die Messung des Analyten in keiner Weise beeinflussen.
Schließlich muss die Konzentration bekannt sein. Dies wird dadurch erreicht, dass der interne Standard nicht nativ in der Probe vorhanden ist; so ist die einzige Einnahmequelle in Lösung die bekannte Konzentration hinzugefügt.
In das folgende Experiment wird die Konzentration von Koffein in einer unbekannten Probe durch Gaschromatographie ermittelt werden.
Dies wird erreicht durch die Schaffung einer Kalibrationskurve mit bekannten Koffein Lösungen mit Adenin als interner Standard. Die Steigung der Kalibrierungskurve entspricht der Responsefaktor.
Sobald der Responsefaktor bekannt ist, kann die Konzentration des unbekannten aus der gemessenen Chromatogramm Flächenverhältnis berechnet werden.
Nun, da Sie die Grundlagen des internen Standards zu verstehen, werfen wir einen Blick auf das Verfahren.
Um den Vorgang zu starten, wiegen Sie genau 100 mg von den internen standard, Adenin, in ein sauberes Becherglas.
Als nächstes in etwa 20 mL Dimethyl Sulfoxid lösen Sie auf, und mischen Sie die Lösung.
Sobald das Adenin aufgelöst hat, füllen Sie die Lösung in eine volumetrische 50-mL-Flasche.
Spülen Sie die Becher und Stir Bar mit 10 mL DMSO und gießen Sie die Spülung in die Flasche. Wiederholen Sie diese spülen zweimal, um die richtige Lösung zu gewährleisten. Zur Kalibrierung Marke, was zu einem internen Standard mit einer Konzentration von 2 mg/mL auffüllen.
Als nächstes wiegen Sie 100 mg Koffein in ein Becherglas eine Stammlösung vorbereiten. Das Koffein mit einer kleinen Menge von Methanol auflösen. Verwenden Sie dann 3 Spülungen, diese Lösung auf einem frischen 25 mL volumetrischen Kolben übertragen. Dies ist der 4 mg/mL Stammlösung. Verwenden Sie es, um 3 Koffein-Standards zu schaffen.
Fügen Sie 0,2 mL der internen standard, Adenin, jedem Kolben. Füllen Sie jeweils auf das Endvolumen mit Methanol. Jede Lösung zu einem Probenfläschchen zu übertragen.
Laufen Sie jeder Koffein-Standard durch einen Gaschromatographen. Berechnen Sie das Verhältnis der Peakflächen für das Koffein im Vergleich zu standard Adenin.
Zunächst wiegen Sie 2 g Kaffee in einen 100-mL-Becherglas, und nehmen Sie das Gewicht.
Als nächstes fügen Sie 20 mL Methanol, das Koffein aus dem Kaffee zu extrahieren. Lassen Sie die Lösung für 20 min rühren.
Über einen Büchner-Trichter, Filtern Sie aus dem Kaffeesatz. Spülen Sie den Becher mit einer kleinen Menge von Methanol und gießen Sie diesem Spülen in den Trichter. Wiederholen Sie die Spülung zweimal.
Der letzte Band der das Filtrat zu messen; Es sollte etwa 35 mL.
Um die Probe für die Analyse vorzubereiten, fügen Sie 1 mL Kaffee-Extrakt zu einem Probenfläschchen. Dann fügen Sie 0,2 mL des internen Standards Adenin, und legen Sie das Fläschchen in das Instrument Auto-Sampler Rack.
Führen Sie eine Gaschromatographie-Analyse der Probe, um sicherzustellen, dass die Bedingungen sind, so dass das Koffein und Adenin getrennt sind.
Berechnen Sie nach Abschluss der Analyse die Peakfläche des internen Standards und der Analyt.
Sobald alle Proben analysiert haben, kann die standard Eichkurve für Koffein/Adenin-Lösungen durch Plotten die Verhältnisse der Peakflächen gegen die Verhältnisse der Konzentrationen bestimmt werden. Die Steigung dieser Linie, die der Responsefaktor darstellt, war 1,8.
Als nächstes werden die GC-Daten aus der extrahierten Kaffee-Probe analysiert. Das Verhältnis von der Peakflächen errechnete 1,78 sein. Mit der Responsefaktor und bekannter Konzentration von den internen standard, Adenin, wurde die Konzentration von Koffein in der unbekannten Probe berechnet 0,33 mg/mL.
Viele verschiedene Arten von Reaktionen in verschiedenen wissenschaftlichen Schüler nutzen interne Standards, um die Auswirkungen von Fehlern und Probenverlust zu minimieren.
Die Auswirkungen der Probenverlust begegnet während der Probenvorbereitung können minimiert werden, mit internen Standards, ihre Konzentration-Verhältnis nahezu konstant zu halten.
In diesem Beispiel wurden bioaktiver Lipide aus lysierten Zellen mit einem flüssig-flüssig-Extraktionsverfahren extrahiert. Stabiler Isotope interne Standards wurden zu Beginn der Extraktion, um Fehler während der Probenvorbereitung berücksichtigen hinzugefügt.
Interne Standards waren nicht nur kritisch für die Vorbereitung der bioaktive Lipide, sondern auch für die Analyse. Die Lipide wurden getrennt, mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und per Massenspektrometrie analysiert.
Spektroskopie hilfst internen Standards korrekt für zufällige Fehler aufgrund von Änderungen in der Intensität der Lichtquelle. Wenn eine Lampe oder andere Lichtquelle Variablen Leistung hat, wirkt sich die Absorption und infolgedessen Emission einer Probe. Jedoch wird das Verhältnis von internem Standard, Analyt bleiben konstant, auch wenn die Lichtquelle nicht der Fall ist.
Chromatographie ist eines der größten Fehlerquellen der Injektion. Auto-Samplern minimieren kann, aber Fehler immer noch 1 – 2 % relative Standardabweichung.
In diesem Beispiel wurden Dampf-Normen mit einem internen Standard mit Gaschromatographie herstellen eine Kalibrationskurve analysiert. Sobald dies abgeschlossen war, konnte dann der unbekannte Probe gemessen werden und die Verluste aufgrund der Volatilität der Probe entfielen.
Sie sah nur Jupiters Einführung in internen Standards. Sie sollten jetzt best Practices für die Minimierung Probenverlust, interne Standards und Antwort Faktoren verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
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Applications and Summary
Interne Standards dienen in vielen Bereichen, einschließlich Spektroskopie und Chromatographie. Spektroskopie hilfst internen Standards korrekt für zufällige Fehler aufgrund von Änderungen in der Intensität der Lichtquelle. Wenn eine Lampe oder andere Lichtquelle Variablen Leistung hat, wirkt sich die Absorption und infolgedessen Emission einer Probe. Jedoch wird das Verhältnis von internem Standard, Analyt bleiben konstant, auch wenn die Lichtquelle nicht der Fall ist. Ein Beispiel hierfür ist Lithium (Li) als interner Standard für die Analyse von Natrium in einer Blutprobe von Flamme Spektroskopie verwenden. Li ist chemisch ähnlich wie Natrium aber nicht nativ im Blut gefunden.
Internen Standards ist für die Chromatographie oft in Gaschromatographie und Flüssigkeitschromatographie eingesetzt. Für Anwendungen mit Massenspektrometrie als Detektor kann der interne Standard eines Analyten isotopischer beschriftet werden, sodass das Molekulargewicht (MW) anders als der Analyten von Interesse sein wird. Internen Standards werden häufig in pharmazeutischen oder ökologische Analysen verwendet.
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