Summary
يصف هذا الإجراء كيفية تأسيس الخلية الأولية الثقافات المكونة للدم من نخاع عظام الفئران وتبعتها ترنسفكأيشن باستخدام الجينات electroporation MXCell بولسير النظام.
Abstract
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن electroporation هي الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأولية. وضعت خصيصا لجين electroporation MXcell بولسير النظام وعازلة لجين electroporation بولسير transfect الأحماض النووية في خلايا الثدييات والتي يصعب transfect الخلايا ، مثل الفيديو cells.This الابتدائي ووقف يوضح كيفية تأسيس الخلية الأولية الثقافات المكونة للدم من نخاع عظام الفئران ويعد بعد ذلك لelectroporation في النظام MXcell. نبدأ من خلال عزل عظم الفخذ والساق. ويتم حصاد ثم نخاع العظام من عظم الفخذ والساق على حد سواء ويتم تأسيس الثقافات. ثم يتم transfected مثقف خلايا نخاع العظام وتحليلها.
Protocol
حصاد نخاع العظام من Femurs وظنبوب
- الخطوة الأولى من هذا الإجراء هو الحصاد نخاع العظم من femurs وظنبوب من 6 -- 12 أسبوعا الماوس القديم (نحن نستخدم BALB / ج الفئران ولكن يمكنك أن تفعل هذا الإجراء مع أي سلالة الماوس). لتبدأ ، الموت ببطء الماوس عن طريق الاستنشاق CO 2 (لن يظهر). عظم الفخذ والظنبوب الحصاد من رجليه الخلفيتين كل منها. ثم ، مع شفرة حلاقة ، وقطع كل نهاية femurs لإزالة مفاصل الورك والركبة وكشف نقي.
- بطريقة مماثلة ، وقطع كل نهاية ظنبوب لإزالة الركبة والكاحل والمناطق المجاورة لفضح نخاع.
- أخذ حقنة 3 مل مع إبرة عيار 26 وملء مع RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ ، والبنسلين ، وستربتوميسين ، وبيتا المركابتويثانول - (BME = 100 أوقية). باستخدام الملقط ، وعقد على مدى عظم طبق بتري تحتوي RPMI وسائل الإعلام. إدراج إبرة حقنة في واحدة من نهاية العظام وتضغط على المكبس لطرد نخاع العظام. يمكن نقل إبرة حقنة صعودا وهبوطا داخل العظم لاخراج نخاع المتبقية.
- كرر الإجراء للعظام في كل شيء ، ومن ثم المضي قدما في إنشاء الثقافات.
إنشاء الثقافات
- لإنشاء الثقافات نخاع العظام ، وماصة للنخاع العظمي مسح صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق النسيج في التعليق الخلية.
- مكان تصفية 70 ميكرون على رأس أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة تعليق الخلية إلى التصفية.
- شطف طبق بيتري مرة واحدة مع RPMI ، ثم تضاف إلى تصفية شطف ميكرون 70.
- استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1 مل ، طحن قطع نخاع العظام المتبقية على رأس تصفية 70 ميكرون.
- يغسل مرة واحدة مع مرشح RPMI.
- بعد غسل تصفية ، أجهزة الطرد المركزي للتعليق في 1200 دورة في الدقيقة خلية لمدة 5 دقائق.
- غسل بيليه الخلية عن طريق إعادة التعليق في برنامج تلفزيوني.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نحصل عادة ~ 90 مليون خلية من عظام one الماوس ، (اثنان زائد femurs ظنبوب اثنين). بعد عد الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي من جديد في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في كمية صغيرة من RPMI وقسامة لهم في قوارير تحتوي على ما يكفي من زراعة الأنسجة RPMI بحيث التركيز النهائي هو 1 مليون خلية لكل مليلتر.
- إضافة السيتوكينات لتعزيز تطوير نوع من الخلايا اهتمامك. في هذه الحالة ، يتم إضافة خلوى انترلوكين - 3 (IL - 3 = 10 نانوغرام / مل) لتشجيع تنمية قعدات والخلايا البدينة. للحصول على قعدات ، يحضن لمدة 10 يوما. للخلايا البدينة ، احتضان لمدة 5 اسابيع. عندما توليد الخلايا البدينة ، ينبغي أن يتم تغيير وسائل الإعلام وIL - 3 مرة واحدة في الاسبوع.
- هنا نظرة على كيف يجب أن تظهر الخلايا البدينة بعد الطلاء. هذه الصورة تدل على تمايز الخلايا في نخاع الأسسة الصاري والخلايا البدينة 10 يوما بعد إضافة انترلوكين - 3.
- مرة واحدة يتم الحصول على نوع من الخلايا المطلوبة ، المضي قدما في خطوة electroporation.
Electroporating خلايا
- بدء الخطوة electroporation ، وتحديد عدد الخلايا في قارورة الثقافة.
- وعادة electroporated الخلايا في مناطق ذات كثافة من 10 مليون دولار لكل مل ، ونقل ذلك عدد الخلايا المطلوبة لأنابيب مخروطية وأنابيب الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي ، نضح وسائل الإعلام ، وغسل الخلايا مع 1X PBS ، ومرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة بيو راد electroporation بولسير جين العازلة لجعل التعليق خلية من 10 مليون خلية لكل مليلتر.
- بعد إعادة التعليق الخلايا ، إضافة DNA البلازميد المطلوب عند تركيز النهائي من 10 إلى 20 ميكروجرام لكل مليلتر.
- قسامة 150 microliters لتعليق خلية في آبار من اختيارك على طبق electroporation 96 - جيدا.
- وضع لوحة في قاعة electroporation وحة MXcell وإغلاق الغطاء.
- قبل ترنسفكأيشن من الخلايا البدينة ، يجب أن تكون مبرمجة على بروتوكول electroporation في MXcell إلا باستخدام بروتوكول مسبقا أو تخزينها. التحسين من خلال التجارب اكتشفنا أن أعلى كفاءة الخلايا البدينة ترنسفكأيشن تحدث باستخدام مربع بروتوكولات نبض الموجة. فإننا سوف تختلف الظروف electroporation على لوحة لتسليم 300V/20ms ، 350/15ms ، 350V/20ms ، والبقول 350V/10ms موجة مربع في 2000uF و 1000 أوم. مرة واحدة وقد تم تعيين البروتوكول وتحميلها على الجهاز ، اضغط على "نبض" لelectroporate الخلايا.
- بعد اكتمال electroporation ، ونقل الخلايا إلى نسيج لوحة الثقافة. نحن عادة نقل كل electroporation ميكروليتر 150 عينة لبئر في لوحة نسيج الثقافة 48 - جيدا يحتوي على 300 microliters RPMI (تستكمل مع 10 ٪ FCS والبنسلين والستربتوميسين ، وبيتا المركابتويثانول) ب 10 نانوغرام لكل مليلتر انترلوكين - 3. يتم تحضين الخلايا ليلا 37 درجة مئوية ، ثم يعاير 24 ساعة في وقت لاحق للتعبير والقمع.
ترانsfection النتائج
يظهر صورة مجهرية الفلورسنت من الخلايا بعد electroporation ناجحة باستخدام 20 ميكروجراما لكل مل GFP البلازميد في الفيديو. ويمكن استخدام نظام الكفاءة electroporation ترنسفكأيشن MXcell من حوالي 30 ٪ يمكن الحصول عليها. نظام يسمح لك أن تختلف الظروف لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الخاص ترنسفكأيشن ، مع الحفاظ على بقاء الخلية.
Discussion
كما يظهر المزيد من المعلومات الجينومية وتطوير أدوات جديدة مثل سيرنا ، أصبح استخدام الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية من أي وقت مضى إلى مزيد من فهمنا للأمراض المسالك ، وتفاعلات البروتينات والبروتين ، ونقل الإشارة. ويتم الحصول على الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة أو سوائل وزراعتها في المختبر. ويمكن التلاعب بها هذه الخلايا في عدد من الطرق ، بما في ذلك من خلال إدخال المادة الجينية الخارجية. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأساسي هو electroporation.
Electroporation يعرض الخلايا لنبضات كهربائية من أجل زيادة عابر نفاذية غشاء الخلية ، مما يسمح الأحماض النووية خارجية لدخول الخلية. يمكن تحسين هذا الأسلوب من ترنسفكأيشن لاستيعاب الاختلافات بين أنواع مختلفة من الخلايا / خطوط ، وبالتالي يمكن استخدامها لtransfect الخلايا البدنية ، فضلا عن غيرها من نخاع العظم أي المستمدة من الخلية. وعلاوة على ذلك ، خلافا لفيروسي بوساطة ترنسفكأيشن ، electroporation لا تفرض قيودا على حجم الحمض النووي transfected ، ولا تتطلب تحضيرا واسعة النطاق. على النقيض من الدهون بوساطة ترنسفكأيشن ، يمكن أن تكون أقل سمية electroporation ، ولا يؤدي في محاصرة endosomal للحامض النووي transfected.
وقد وضعت الحيوي راد نظام electroporation MXcell خصيصا لهذه الخلايا. ويسمح لك MXcell تختلف الظروف لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة والصلاحية الخاص ترنسفكأيشن الخلية. من أجل تحسين الكفاءة وتقليل ترنسفكأيشن موت الخلايا ، وعدد كبير من المعلمات electroporation بما في ذلك الجهد ، يمكن تعديل السعة ، والمقاومة ، وطول النبضة وتقييمها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
