Overview
Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton - University of Virginia
Chromatographie d’échange ionique est un type de chromatographie qui sépare les analytes issu des frais. Une colonne est utilisée qui est remplie d’une phase stationnaire chargée sur un support solide, appelé une résine échangeuse d’ions. Chromatographie échangeuse de cations forts sépare préférentiellement les cations en utilisant une résine chargée négativement, tandis que la chromatographie échangeuse d’anions forts choisit préférentiellement des anions à l’aide d’une résine chargée positivement. Ce type de chromatographie est apprécié pour la préparation de l’échantillon, par exemple dans le nettoyage des protéines ou des acides nucléiques des échantillons.
Chromatographie d’échange ionique est un processus en deux étapes. Dans un premier temps, l’échantillon est chargé sur la colonne dans un tampon de charge. La liaison de l’échantillon chargée à la résine de colonne est basée sur des interactions ioniques de la résine pour attirer l’échantillon de charge opposée. Ainsi, les échantillons chargés de polarité opposée à la résine sont fortement liés. Autres molécules qui ne payent pas ou sont de charge opposée ne sont pas liés et sont lavés par le biais de la colonne. La deuxième étape consiste à éluer l’analyte qui est lié à la résine. Ceci est accompli avec un gradient de sel, où la quantité de sel dans la mémoire tampon est lentement augmentée. Fractions sont encaissées à la fin de la colonne que l’élution se produit et l’échantillon purifié d’intérêt peut être récupéré dans l’une de ces fractions. Une autre technique, telles que la spectroscopie, peut être nécessaire d’identifier quelle fraction contient l’échantillon. Chromatographie d’échange ionique est particulièrement utile dans les études de protéine, d’isoler les protéines d’intérêt qui ont une charge spécifique ou la taille, car la taille permet de déterminer le nombre d’interactions avec la résine.
Chromatographie d’échange ionique est une technique de séparation plus générale que la chromatographie d’affinité, qui est aussi souvent utilisée dans la préparation des échantillons de protéine, où un anticorps est liée à une colonne pour lier un analyte spécifique. Une nouvelle colonne d’affinité doit être achetée pour chaque analyte, tandis que le même type de colonne échangeuse d’ions, souvent atteints de différents troubles élution, peut servir à nettoyer les nombreuses protéines ayant la même charge. Chromatographie échangeuse d’ions peut également servir en conjonction avec d’autres types de chromatographie qui séparent basé sur d’autres propriétés. Par exemple, chromatographie d’exclusion stérique se sépare selon la taille et pourrait être utilisée avant la chromatographie échangeuse d’ions pour choisir composés de seulement une taille donnée.
Principles
Chromatographie d’échange ionique est régie par les principes des interactions chimiques ioniques qui mènent à l’adsorption réversible de l’analyte sur la phase stationnaire. La force de la liaison entre l’échantillon et le support solide est régie par le nombre et les types de groupes fonctionnels sur l’échantillon et la résine. Le tampon de charge est généralement faible conductivité afin de promouvoir les interactions entre l’échantillon et la résine. Résines échangeuses de cations forts sont généralement des groupes fonctionnels acide sulfonique tandis que résines échangeuse de cations faibles ont des acides carboxyliques. Résines d’échange anionique fortes contiennent amines quaternaires, tandis que les résines échangeuse d’anions faible amines secondaires ou tertiaires de fonctionnalité. Les termes forts et faibles font référence aux propriétés de la matière de la colonne et pas dans quelle mesure il lie d’un analyte acide/base. Résines faibles sont facturés sur une plage de pH plus petite que des résines solides, mais toujours lient les analytes très efficacement et pourraient être un bon choix si elles sont chargées dans la plage de pH nécessaire. Avant utilisation, colonnes échangeuses d’ions sont équilibrés à un pH à l’aide d’un tampon d’équilibration.
Pour éluer l’échantillon, un gradient de sel est utilisé. Les échantillons qui sont moins étroitement liés à la résine vont éluer tout d’abord, comme le sel se gênent plus facilement leur liaison ionique de la colonne. Les échantillons qui sont plus étroitement lié va éluer plus tard, lorsqu’on utilise des quantités plus élevées de sel. En règle générale, un dégradé linéaire de sel est utilisé, où la concentration en sel augmente au fil du temps de façon linéaire. Toutefois, des gradients de l’étape peuvent être utilisés où la concentration de sel est intensifiée au fil du temps.
Une considération importante pour les expériences d’échange ionique est le pH des tampons. Le pH doit être maintenu pour que l’analyte d’intérêt est chargé et se liera à la résine. Pour les protéines, l’accusation repose sur le point isoélectrique de la protéine, où la protéine est chargée de manière neutre et mesurée comme pI. Le pH en comparaison de la pI de la protéine donne des informations sur l’accusation de protéine attendue. En chromatographie échangeuse de cations, élévation du pH provoque l’analyte à être moins positivement chargée et moins susceptible d’interagir avec la résine chargée négativement. De même, en chromatographie échangeuse d’anions, abaissement du pH provoque l’analyte charge moins négative et moins susceptible d’interagir avec la résine chargée positivement. Ainsi des ajustements de pH permet également à éluer sélectivement les analytes de la colonne. L’utilisation d’ajustements du pH au lieu de sels pourrait être avantageuse pour séparer deux types différents de protéines avec des valeurs différentes de pI.
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Procedure
1. préparation de l’échantillon et la colonne
- Dans cette démonstration, un mélange de 2 protéines est séparé sur une colonne échangeuse de cations : hémoglobine et le cytochrome C. Ajouter 0,2 mL équilibration tampon (pH 8,1) dans l’échantillon de la protéine et les vortex pour bien mélanger. Centrifuger pendant 2 min enlever toute la mousse.
- Placer la colonne échangeuse de cations dans un tube à essai pendant 5 min permettre à la résine pour s’installer. Fixer le tube à essai avec la colonne sur un trépied anneau pour s’assurer que c’est en position verticale.
- Ouvrez le capuchon supérieur de la colonne, puis le couvercle inférieur. Laisser le tampon dans la colonne à s’écouler dehors par gravité dans le tube à essai.
- Laver la colonne avec un colonne-volume (dans ce cas le volume de la colonne est 0,3 mL) de tampon de l’équilibration. Laissez la première colonne-volume (0,3 mL) d’équilibration tampon goutte à goutte sur le flacon des déchets avant d’ajouter la deuxième colonne-volume. Cette étape permet la colonne équilibrer avec le tampon de l’équilibration. Ajouter lentement le tampon d’équilibration dans cette étape ne pas déranger la résine.
2. exécuter un échantillon de protéine à travers une colonne échangeuse de cations
- Mettre la colonne dans un tube à centrifuger 2 mL étiqueté « Unbound 1 ». Soigneusement charger 0,1 mL de l’échantillon de protéines sur le haut de la colonne.
- Une fois que l’échantillon a été chargé sur le dessus de la colonne, lavez-le avec 0,3 mL de tampon de l’équilibration en ajoutant de la mémoire tampon dans la partie supérieure de la colonne et laissez-le s’égoutter complètement. Répétez cette étape 4 x (pour un total de 5 lavages) et recueillir chaque lavage dans un tube à centrifuger séparée, de 2 mL. Marquer les tubes comme « Unbound 1-5 ».
- Pour les 2 derniers lavages, centrifuger pendant 10 s à 1 000 x g pour s’assurer que toutes les espèces non consolidés sont détacher de la colonne. Tout échantillon qui se lie à la colonne ne doit pas être dans ces lavages, mais échantillon qui ne lie pas lavera consignes. Centrifugation fournit plus de force pour les matériaux non lié au large de la colonne de lavage.
- Mettre la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de centrifugeuse 2 mL étiqueté « Bound 1 ». Mettre 0,3 mL de tampon d’élution (haut sel, pH 5,5) sur le dessus de la colonne. Centrifuger l’éluant qui en résulte pour 10 s à 1 000 x g.
- Répéter l’étape d’élution 2 fois plus en plaçant la colonne dans un nouveau tube à centrifuger, ajouter 0,3 mL, et centrifugation pendant 10 s. étiquette ces « Bound 2 et 3 ».
- Enregistrer tous les changements de couleur ou observations sur les fractions. L’hémoglobine est une protéine de couleur qui ressemble brun-rougeâtre, tandis que le cytochrome C est de couleur rougeâtre.
3. résultats : Échangeuse de cations de l’hémoglobine et du Cytochrome C
- Cytochrome C a un pI de 10,5 et hémoglobine un pI de 6,8. Ainsi, lorsqu’on utilise un tampon de l’équilibration du pH 8.1, l’hémoglobine ne lie pas à la colonne parce qu’il est chargé négativement. Cytochrome C est chargé positivement à ce pH et soit lié à la colonne car le pH < pI.
- L’hémoglobine est observée dans les fractions non liées, car il n’est pas lié à la colonne.
- Cytochrome C est observée dans les fractions liées, parce qu’elle était liée à la colonne échangeuse de cations.
La figure 1. Photo de la fraction libre (hémoglobine) et la fraction liée (cytochrome C).
Chromatographie d’échange ionique est employé couramment dans la séparation et l’isolement de composés chargés, biomolécules particulièrement grand.
Ce type de chromatographie en phase liquide utilise une colonne de paniers perles de phase stationnaire, appelé résine. La technique sépare les analytes basée sur leur affinité avec la résine chargée.
Il y a deux types principaux de cette technique. En chromatographie échangeuse de cations, résine de charge négative est utilisé pour lier des analytes chargés positivement. De même, en échange d’anions, charge négative analytes lier à résine chargée positivement. Les composés non liés sont lavés par le biais de la colonne et l’analyte peut ensuite être recueilli dans un récipient séparé.
Cette vidéo va introduire les bases de la chromatographie échangeuse d’ions et démontrer la technique de séparation d’un mélange de protéines dans le laboratoire.
La phase stationnaire est un élément clé pour une séparation réussie. Résines échangeuse de cations forts courses présentent de forts groupes fonctionnels acides, tels que l’acide sulfonique. Résines échangeuses de cations faibles en vedette des groupes vulnérables, tels que les acides carboxyliques.
De même, résines échangeuses d’anions forts utilisent des bases fortes, comme les amines quaternaires, alors que les résines échangeuses d’anions faibles utilisent des amines secondaires ou tertiaires. La sélection de résine dépendra les propriétés du mélange témoin et l’analyte d’intérêt.
Les tampons utilisés, collectivement appelés la phase mobile, sont également importants à une séparation, notamment en termes de pH. Pour les protéines, pH est sélectionnée selon son point isoélectrique, ou pI. À un pH égal à pI de la protéine, la protéine est neutre. Au-dessus de la pI, il aura une charge nette négative, tandis qu’au-dessous de la pI, il aura une charge positive nette. Le tampon pH doit être sélectionné si la protéine est correctement chargé et peut se lier à la phase stationnaire.
Chromatographie d’échange ionique est généralement un processus en quatre étapes. Tout d’abord, une colonne à garnissage contenant une résine échangeuse d’anions ou -cation est équilibrée à l’aide de la mémoire tampon. Il s’agit de colonnes échangeuses d’anions, protonant la résine, s’assurant qu'il est chargé positivement.
Ensuite, l’échantillon est chargé sur la colonne. La mémoire tampon doit avoir faible conductivité, chargée des espèces ne peuvent rivaliser avec l’échantillon pour les interactions avec la résine. Composés de charge opposée se lient à la résine. Les molécules qui ne payent pas, ou qui portent la même charge, restent indépendants.
Dans la troisième étape, la colonne est lavée avec un tampon supplémentaire pour supprimer les composants non liés de la colonne, abandonnant la limite.
Enfin, la quatrième étape est l’élution de l’analyte lié. Ceci est accompli en utilisant un gradient de sel, où la concentration en sel est progressivement augmentée, ou à l’aide d’un tampon d’élution sel élevé.
Les molécules qui sont faiblement liés vont être élués tout d’abord, comme le sel faible perturbera plus facilement leur liaison ionique à la résine. Les composés qui sont plus fortement liés seront éluer avec des concentrations plus élevées de sels.
Maintenant que les bases de la chromatographie d’échange ionique ont été soulignées, permet de jeter un oeil à son utilisation dans la séparation des deux protéines.
Tout d’abord, pour préparer le mélange de protéines pour la séparation, ajouter 0,2 mL de tampon de liaison et de vortex pour bien mélanger. Puis, centrifuger le mélange pour enlever toute la mousse. Pour préparer la colonne échangeuse de cations, il pince verticalement sur un support de bague et laissez la résine s’installer.
Ouvrez le capuchon supérieur de la colonne, puis le bas. Laisser le tampon s’écouler dehors par gravité dans un tube ci-dessous.
Pour préparer la colonne, l’équilibrer en chargeant un colonne-volume de tampon, dans ce cas 0,3 mL. Laisser le tampon de s’écouler hors de la colonne dans un flacon de déchets. Après que vous avez quitté un colonne-volume de tampon, répétez l’étape de l’équilibration.
Pour exécuter l’expérience, placez un tube à centrifuger de 2 mL étiqueté « Unbound 1 » au-dessous de la colonne. Soigneusement charger 0,1 mL de l’échantillon de protéines sur le haut de la colonne.
Une fois que l’échantillon a été chargé, avec un colonne-volume de tampon de lavage et laissez-le s’écouler tout au long. Répéter pour un total de 5 lavages. Collecter chaque lavage dans son propre tube, étiqueté « Unbound 1 » à « 5 ». Pour les 2 derniers lavages, centrifuger la colonne pendant 10 s pour s’assurer que toutes les espèces non liés lavent la colonne. Mettre la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL Centrifugeuse et étiquette il « Bound 1 ». Charge 1 colonne-volume de tampon d’élution sur le dessus de la colonne. Centrifuger pendant 10 s à 1 000 x g.
Répéter l’étape d’élution 2 fois plus d’assurer la perception de l’analyte lié. Identifier les tubes « Bound 2 » et « 3 ». Enregistrer tous les changements de couleur ou observations sur les fractions.
Dans cet exemple, l’hémoglobine et le cytochrome C, ont été séparés. L’hémoglobine a un pI de 6,8, tandis que le cytochrome C a un pI de 10,5. Dans le tampon pH 8.1, l’hémoglobine est chargée négativement et ne se lie pas à la colonne. À l’inverse, le cytochrome C est chargé positivement à un pH de 8,1 et se lie à la colonne.
L’hémoglobine, une protéine de couleur brunâtre, se trouvait dans les fractions non liées, tandis que le cytochrome C, une protéine de couleur rougeâtre, a été observé dans la fraction liée.
Il existe de nombreuses formes de chromatographie en phase liquide, chacun avec des capacités différentes pour séparer les composants d’un mélange.
Dans cet exemple, chromatographie sur colonne a été utilisée pour séparer un mélange d’ADN bicaténaire simple et double. Hydroxyapatite ou HA, est une forme cristalline de phosphate de calcium utilisent généralement comme une phase stationnaire en raison de ses ions calcium chargé positivement. Dans ce cas, la colonne HA est idéale pour la séparation de l’ADN, car il peut lier au backbone de charge négative de l’ADN.
Une autre forme de chromatographie sur colonne, fréquemment utilisé pour séparer des protéines est la chromatographie d’affinité métallique immobilisée ou IMAC. IMAC, la phase stationnaire possède un ligand avec un ion métallique, qui l’associe à une étiquette histidine sur la protéine d’intérêt.
Tous les autres composants du mélange de sortie de la colonne. La protéine est ensuite éluée avec une solution de l’imidazole, qui a une structure similaire à l’histidine et se lie plus fortement avec l’ion métallique.
Une application courante de la chromatographie sur colonne de chromatographie liquide à haute performance, soit HPLC. HPLC est largement utilisé en chimie analytique pour l’identification et la séparation de composés biologiques et non biologiques dans un mélange.
HPLC est similaire à la chromatographie sur colonne fait preuve dans cette vidéo, sauf que c’est automatisé et fonctionnant à des pressions très élevées. Cela permet d’utiliser de petites perles de phase stationnaire, ayant une surface supérieure à rapport volumétrique. Ainsi, les interactions améliorées entre la phase stationnaire et les composants dans la phase mobile sont possibles.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour chromatographie échangeuse d’ions. Vous devez maintenant comprendre les concepts derrière elle, les 4 étapes et quelques techniques connexes.
Merci de regarder !
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Applications and Summary
Chromatographie d’échange ionique est largement utilisée en biochimie pour isoler et purifier les échantillons de protéines. Les protéines ont plusieurs acides aminés avec groupes fonctionnels qui sont facturés. Les protéines sont séparées basé sur la charge nette, qui dépend de la pH. Certaines protéines sont facturés plus positivement tandis que d’autres portent une charge plus négative. En outre, balises de peptide peuvent être génétiquement ajoutés à une protéine pour lui donner un point isoélectrique qui n'est pas dans la gamme des protéines normales, rendant possible de séparer complètement. Chromatographie échangeuse d’ions est utile pour séparer des complexes de protéines multimériques, comme différentes configurations aurait différentes quantités de charge et les différentes interactions.
Une autre application majeure de chromatographie échangeuse d’ions est analyse de l’eau. Chromatographie échangeuse d’anions peut être utilisée pour mesurer la concentration des anions, y compris des sulfates, de nitrates, de nitrites, de fluorure et de chlorure. Chromatographie échangeuse de cations est utilisée pour mesurer la concentration de cations tels que sodium, potassium, calcium et magnésium. Un type de chromatographie échangeuse d’ions est également utilisé dans la purification de l’eau, comme la plupart adoucisseurs d’eau filtrer les ions calcium et du magnésium dans l’eau dure en les liant à une résine, qui libère le sodium dépendant. Métaux lourds comme le cuivre ou le plomb, peut également être retirés de l’eau à l’aide de la chromatographie échangeuse d’ions.
Chromatographie d’échange ionique est également utile dans la purification de métal. Il peut être utilisé pour purifier les actanides, comme le plutonium et retirez-la de barres de combustible irradié des réacteurs nucléaires. Il peut également servir à récupérer l’uranium et retirez-la de l’eau ou d’autres échantillons environnementaux.
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