Summary
तंत्रिका प्रेरण मस्तिष्क के गठन में पहला कदम है. यह एक तंत्र है जिसके द्वारा Hensen (आयोजक) नोड, आसन्न ऊतकों को निर्देश एक तंत्रिका भाग्य अपनाने है, यानी तंत्रिका तंत्र को जन्म दे. इस वीडियो लड़की भ्रूण में तंत्रिका शामिल होने के लिए एक परख को दर्शाता है.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह और तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक patterning के गठन के अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. इस वीडियो को दर्शाता है कैसे एक मेजबान में भ्रष्टाचार के आयोजक के ऊतकों को, जो एक विधि Hensen नोड (लड़की भ्रूण में आयोजक) एक मेजबान सक्षम बाह्य त्वक स्तर के लिए grafted है. आयोजक भ्रष्टाचार ना ऊतक ve न्यूरल उत्प्रेरण संकेतों के माध्यम से एक तंत्रिका भाग्य अपनाने overlying निर्देश देता है. इस तंत्र तंत्रिका प्रेरण के रूप में संदर्भित किया जाता है, और और amniotes में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के गठन में प्रारंभिक कदम का गठन किया है. इस पद्धति का अनिवार्य रूप से ख्यात लड़की में तंत्रिका उत्प्रेरण अणुओं के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है. इस वीडियो तंत्रिका शामिल होने के लिए परख में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहला, donnor भ्रूण explanted है और एक डिश पर टिकी है. फिर, मेजबान भ्रूण नई संस्कृति के लिए तैयार है. भ्रष्टाचार excised है और मेजबान क्षेत्र pellucida मार्जिन में प्रत्यारोपित. मेजबान 18-22 बजे के लिए सभ्य है. विधानसभा और तय है और आगे अनुप्रयोगों (जैसे में स्वस्थानी संकरण) के लिए कार्रवाई की जाती है. इस पद्धति का मूल Waddington द्वारा तैयार किया गया था
Protocol
मैं योजनाबद्ध अवलोकन:
इस वीडियो में लड़की भ्रूण में तंत्रिका शामिल होने के लिए परख में विभिन्न चरणों को दर्शाता है. सबसे पहले, मेजबान भ्रूण नई संस्कृति में explanted है [NI1] फिर, donnor भ्रूण खारा और Hensen नोड (चूजा में "आयोजक") में explanted है फ्लोरोसेंट रंजक DiI के साथ लेबल है. [NI2] Hensen नोड donnor भ्रूण से excised है [NI3] और मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित [NI4, NI5]. मेजबान भ्रूण तो 22 बजे के लिए सभ्य है जो अवधि के बाद donnor ऊतक मेजबान क्षेत्र में एक अस्थानिक अक्ष प्रेरित है opaca [NI6] संस्कृति के बाद, मेजबान भ्रूण तय की और थपका की उपस्थिति में photooxidation के लिए संसाधित: इस रासायनिक प्रतिक्रिया, donnor व्युत्पन्न कोशिकाओं, जो FITC प्रतिदीप्ति के तहत लाल [NI7] photooxidation के लिए पहले दिखाई देते हैं, थपका के साथ भूरे रंग निम्नलिखित प्रतिक्रिया बन [NI8] भ्रूण स्वस्थानी संकरण में तो के लिए एक तंत्रिका मार्कर [NI8] के साथ संसाधित, मेजबान व्युत्पन्न ऊतक donnor भ्रष्टाचार की उपस्थिति में तंत्रिका ऊतक का गठन किया है. इस ऊतक नीला दिखाई देता है.
1: नई संस्कृति के लिए मेजबान भ्रूण की तैयारी
- यह तंत्रिका प्रेरण परख प्रोटोकॉल अंडे कि हैम्बर्गर और हैमिल्टन चरण 3 incubated किया गया है के साथ शुरू होता है + (या HH3 +). ये अंडे incubated दिया गया है 13 घंटे के लिए एक नम इनक्यूबेटर में अपने पक्ष पर रखी.
- नई संस्कृति (3.1 चरणों 9 5.5.) के लिए मेजबान भ्रूण तैयार .
- 200 μl खारा के साथ मेजबान भ्रूण की सतह को कवर. यह बाद में हस्तांतरण और donnor भ्रष्टाचार की स्थिति को सुविधा होगी.
- अंत में, एक औंधा फाल्कन 35 मिमी संस्कृति डिश के साथ विधानसभा को कवर.
2: खारा में donnor भ्रूण Explanting
- संदंश के साथ खोल पर दोहन और खोल के टुकड़े को खोल के आसपास, हटाने के द्वारा अंडे खोलें. खोल के ऊपर निकालें और त्यागने.
- संदंश के साथ मोटी albumin निकालें, और मोटे संदंश के साथ जर्दी थैली झुकाव इतना है कि भ्रूण ऊपर की तरफ चेहरे.
- ठीक कैंची का प्रयोग, जर्दी थैली भ्रूण के आसपास के एक वर्ग में कटौती. एक चम्मच के साथ जर्दी से भ्रूण निकालें, और पीबीएस युक्त पकवान में जगह.
- संदंश का प्रयोग, क्षेत्र pellucida से donnor भ्रूण अलग.
- स्थानांतरण donnor Sylgard कवर पीबीएस युक्त डिश के लिए भ्रूण.
3: लेबल, excising और donnor भ्रष्टाचार रोपाई
- एक microelectrode खींचने का उपयोग, 50 μl कांच microcapillary pipettes खींच. खुर्दबीन के तहत, ठीक संदंश का उपयोग micropipette की नोक काटा. एक पेट्री डिश में रखें micropipette plasteline की एक रिबन के साथ खड़े हैं.
- डाई समाधान है जो पहले प्रत्यारोपण भ्रष्टाचार लेबल किया जाएगा तैयार: डाई (1,1 'dioctadecyl-3, 3,3', perchlorate 3'-tetramethylindocarbocyanine) DiI carbocyanine: पहले, 1ml में DiI के एक शेयर तैयार निरपेक्ष इथेनॉल 0.5% पर. इस अंधेरे में-20C शेयर पर संग्रहीत किया जा सकता है. एक पानी स्नान में 42 पर सेट डिग्री सेल्सियस, मिश्रण 360μl 0.3M sucrose के लिए 40 μl DiI शेयर prewarmed. पानी के स्नान के तापमान DiI और अघुलनशील क्रिस्टल के गठन की तेज़ी को रोकने के लिए क्रम में आवश्यक है. संक्षेप में एक मिनी spectrafuge पर समाधान (5-10 सेकंड के लिए) स्पिन. DiI समाधान का उपयोग करने के लिए तैयार है.
- कीट पिन का प्रयोग, Sylgard कवर डिश के तल पर donnor भ्रूण सुरक्षित.
- वापस भरने DiI साथ micropipette. कोमल एक Aspirator ट्यूब विधानसभा का उपयोग करते हुए दबाव लागू करके, Hensen नोड DiI के एक छोटे से सांस में लागू होते हैं. सुनिश्चित करें कि पूरे Hensen नोड लेबल है.
- एक microcapillary विंदुक या एक microdissecting चाकू का प्रयोग, Hensen नोड ("आयोजक", donnor भ्रष्टाचार) में कटौती.
- उदर पक्ष और लाल रंग के साथ भ्रष्टाचार के पीछे अंत मार्क. इससे यह सुनिश्चित होगा कि भ्रष्टाचार 4.3 चरण में उचित ओरिएंटेशन dorso उदर के साथ तैनात है.
- एक 200μl Gilson विंदुक का प्रयोग, मेजबान भ्रूण को भ्रष्टाचार हस्तांतरण.
4: भ्रष्टाचार और संवर्धन मेजबान भ्रूण सुरक्षा
- मेजबान भ्रूण से खारा निकालें, यकीन है कि भ्रष्टाचार मेजबान साइट के साथ करीब निकटता में तैनात रहता है.
- एक microcapillary विंदुक या एक microdissecting चाकू का प्रयोग, क्षेत्र / pellucida क्षेत्र opaca सीमा क्षेत्र में मेजबान भ्रूण के Hensen नोड के स्तर पर एक छोटा सा चीरा (80 100μm), कर.
- Microcapillary विंदुक या एक microdissecting चाकू स्थिति, भ्रष्टाचार का प्रयोग इतना है कि उदर पक्ष तुम और पीछे के अंत की ओर चेहरे मेजबान भ्रूण में बराबर क्षेत्र के समानांतर है.
- शेष खारा निकालें, और 81-22 घंटा (6.1 चरणों 9 6.6) के लिए नई संस्कृति के लिए मेजबान भ्रूण की प्रक्रिया.
- मेजबान भ्रूण तो 4 डिग्री सेल्सियस (कदम 9 7.1 करने के लिए 7.7) रातोंरात तय है .
- धूआं हुड के तहत, Tris बफर में एक थपका काम कर समाधान तैयार: थपका सब्सट्रेट भंग (3,3 tetrahydrochloride 'diaminobenzidine) 500μg/ml पर बफर Tris (100mm Tris - एचसीएल, पीएच 7.4) में, अंधेरे में समाधान बर्फ पर रखने.
- भ्रूण पीबीएस में दो बार 5 करोड़ के लिए 5 करोड़ के लिए प्रत्येक और Tris बफर में एक बार धो.
- एक गिलास गुहा 1 मिलीलीटर Tris बफर युक्त स्लाइड करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण.
- Tris समाधान बफर 1.5 मिलीलीटर थपका समाधान के साथ बदलें. बाल्टी में एक 10% ब्लीच समाधान युक्त क्रम में थपका शुद्ध करना Eppendorf टिप को फेंक. गुहा स्लाइड के शीर्ष पर एक coverslip रखें.
- FITC प्रतिदीप्ति (fluorescein आइसोथियोसाइनेट) के तहत, (donnor कोशिकाओं फ्लोरोसेंट लाल दिखाई देगा) भ्रष्टाचार पर माइक्रोस्कोप के उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करने और FITC प्रतिदीप्ति को बेनकाब जब तक सभी फ्लोरोसेंट लाल कोशिकाओं (यह DiI का एक परिणाम के के रूप में होता है भूरे रंग के हो गए हैं photoconverted जा रहा fluorochrome अघुलनशील भूरे रंग के क्रिस्टल करने के लिए, थपका की उपस्थिति में FITC उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (488nm). जोखिम से इस प्रक्रिया को 20 करोड़ और 2 घंटे के बीच लेता है.
- Photooxidation प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, ठीक संदंश का उपयोग coverslip हटा दें. एक 20 मिलीलीटर जगमगाहट PBTw (या 0.1% बीच - 20 के साथ पीबीएस) युक्त गिलास शीशी भ्रूण स्थानांतरण.
- Coverslip और गिलास गुहा स्लाइड से 10% ब्लीच समाधान में incubating थपका निष्क्रिय.
6: के लिए स्वस्थानी संकरण, फोटोग्राफी, और इस प्रक्रिया में भ्रूण सेक्शनिंग
- स्वस्थानी संकरण (3.7 चरणों 9 6.5) के साथ आगे बढ़ें, केवल लेबल जांच डीआईजी के लिए भ्रूण incubating.
- (नौ 8.2 कदम) photographing और सेक्शनिंग (8.3 कदम और 8.4 9) के साथ आगे बढ़ें.
प्रतिनिधि परिणाम
तंत्रिका प्रेरण परख के निम्न उदाहरण में दिखाया गया है, donnor भ्रष्टाचार मेजबान ऊतक से व्युत्पन्न तंत्रिका मार्कर बिना पूंछ की अभिव्यक्ति प्रेरित. Donnor भ्रष्टाचार एक भ्रूण "आयोजक" क्षेत्र में जो शल्य चिकित्सा गया है स्तर पर donnor भ्रूण से हटा से originates: इस विशिष्ट उदाहरण में, हम भ्रूण क्षेत्रों में से एक है जो आम तौर पर "आयोजक" क्षमताओं नहीं है तंत्रिका उत्प्रेरण क्षमता के अधिग्रहण का आकलन 3 +. बाद पृथक, donnor भ्रूण नई संस्कृति में विकसित करने की अनुमति दी है, जब तक छेद और चंगा Hensen नोड जैसी संरचना का गठन किया है. यह संरचना तो DiI साथ लेबल है, donnor भ्रूण से excised और क्षेत्र / pellucida क्षेत्र एक मेजबान भ्रूण के opaca सीमा करने के लिए grafted. नई संस्कृति के बाद, एक लघु अक्ष मेजबान भ्रूण के निकट बनाई है: इस लघु अक्ष लाल कोशिकाओं के एक छड़ी (donnor प्राप्त) और एक सिर की तरह संरचना (व्युत्पन्न मेजबान) के होते हैं: (ए), donnor व्युत्पन्न DiI लेबल कोशिकाओं निर्धारण करने के लिए पहले FITC प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत दिखाए जाते हैं. ये donnor व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए एक लघु notochord है, जो लाल कोशिकाओं की छड़ी के रूप में प्रकट होता है फार्म proliferated है. (बी) DiI के बाद photoconversion, इन donnor कोशिकाओं व्युत्पन्न भूरे रंग के दिखाई देते हैं. donnor भ्रष्टाचार मेजबान से तंत्रिका ऊतक के गठन प्रेरित है: इस ऊतक मस्तिष्क के लिए व्यापारियों की होते हैं, के रूप में स्वस्थानी संकरण में मार्कर के बिना पूंछ निम्नलिखित के लिए उनकी अभिव्यक्ति से पता चला [6 से reprinted].
नोट: इस प्रक्रिया में, हम DiI लेबल कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है क्रम में "तंत्रिका ऊतक" (नीला) व्युत्पन्न मेजबान से तंत्रिका उत्प्रेरण donnor ऊतक (लाल / भूरे रंग का) अंतर है. एक व्युत्पन्न लड़की, DiI लेबल donnor भ्रष्टाचार का उपयोग करने के बजाय, कुछ लेखकों को भी donnor ऊतक लड़की के बजाय बटेर भ्रूण से निकाली गई. [6 जैसे] का उपयोग करें यह वैकल्पिक विधि भी मेजबान के ऊतकों से donnor अंतर की अनुमति देता है. इस मामले में भ्रष्टाचार (donnor ऊतक) चिकन अंडे के बजाय बटेर अंडे से निकलती है. 4.5 कदम के बाद, मेजबान एक 3.4 और 5,7 करने के लिए 5,1 (QCP1) ऊतक और 3.1 कदम बटेर विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पूरे माउंट immunohistochemistry के लिए संसाधित है प्रोटोकॉल से छोड़े गए हैं. इस वैकल्पिक प्रक्रिया का एक उदाहरण नीचे दिखाया गया है: इस मामले में, हम के रूप में ए, बी में एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है, लेकिन हम बटेर व्युत्पन्न donnor ऊतक का इस्तेमाल किया (के रूप में QCPN एंटीबॉडी [भूरे रंग] की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया गया है): पुनर्जीवित बटेर भ्रूण से प्राप्त नोड मेजबान में अखिल तंत्रिका मार्कर Sox2 की अभिव्यक्ति प्रेरित है [6 से reprinted]
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Discussion
यह वीडियो तंत्रिका शामिल होने के लिए एक परख प्रदर्शन में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, यह परख ख्यात लड़की में तंत्रिका उत्प्रेरण अणुओं के लक्षण वर्णन के लिए अनिवार्य रूप से प्रयोग किया जाता है, और इस प्रकार आवेदनों की एक विस्तृत विविधता, embryological micromanipulations से 1-4 लेकर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; 6 unraveling नए संकेत cascades 7,8, सभी मस्तिष्क और शेष तंत्रिका तंत्र के गठन में प्रारंभिक कदम के समझने के लिए लक्ष्य .
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Acknowledgments
डीपी रुथ Kirschstein पुरस्कार DA021977 01A1-1F32 के नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान से प्राप्तकर्ता है. यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
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