Summary
الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.
Abstract
الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة تشكيل والزخرفة الأولية للنظام العصبي. هذا الفيديو يوضح كيفية نسيج منظم الكسب غير المشروع إلى المضيف ، والطريقة التي يتم المطعمة عقدة هنسن ق (المنظم في جنين الفرخ) إلى الأديم الظاهر المضيف المختصة. الكسب غير المشروع منظم يرشد المغطي غ لقد الأنسجة لاعتماد مصير العصبية عبر إشارات العصبية المحفزة. ويشار إلى هذه الآلية والحث العصبي ، ويشكل الخطوة الأولى في تكوين الدماغ والحبل الشوكي في amniotes. ويستخدم هذا الأسلوب أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي ؛ أولا ، explanted الجنين donnor ويعلق على طبق. ثم ، على استعداد الجنين المضيف للثقافة الجديدة. والكسب غير المشروع ورفعه إلى الهامش زرع المنطقة الشفافة المضيف. هو مثقف المضيف 18-22 ساعة. تم إصلاح التجمع وتجهيزها لتطبيقات أخرى (مثل التهجين في الموقع). ولقد ابتكر هذا الأسلوب أصلا بواسطة ادينغتون
Protocol
أولا تخطيطي لمحة عامة :
هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ. الأول ، هو explanted الجنين المضيف في ثقافة جديدة [NI1]. إذن ، هو explanted الجنين donnor في المياه المالحة وعقدة هنسن (في "منظم" في الفرخ) هو المسمى مع صبغة الفلورسنت الجاذبة [NI2]. ويستأصل عقدة هنسن من جنين donnor [NI3] وزرع الجنين إلى المضيف [NI4 ، NI5]. هو مثقف ثم الجنين المضيف لتصل إلى 22 ساعة ، وبعد هذه الفترة النسيج donnor قد يسببها محور خارج الرحم في منطقة المضيف المعتمة [NI6]. التالية والثقافة ، ويتم إصلاح الجنين المضيف والمجهزة للphotooxidation في حضور DAB : بواسطة هذا التفاعل الكيميائي ، والخلايا المشتقة donnor ، والتي تظهر تحت الحمراء مضان FITC قبل photooxidation [NI7] ، وتصبح ردود الفعل التالية البني مع DAB [NI8]. ثم تتم معالجة الجنين للتهجين في الموضع مع علامة العصبية [NI8] ؛ الأنسجة المشتقة المضيف شكلت الأنسجة العصبية في وجود الفساد donnor. هذا النسيج يظهر اللون الأزرق.
1 : تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة
- هذا الاختبار الحث العصبي بروتوكول يبدأ مع البيض التي تم المحتضنة للهمبرغر وهاميلتون المرحلة 3 + (أو HH3 +). وقد حضنت هذه البويضات وضعت على جانبهم في حاضنة الرطبة لمدة 13 ساعة.
- تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة (الخطوات 3.1. إلى 5.5 9).
- تغطية سطح الجنين المضيف مع 200 ميكرولتر المالحة. وهذا تسهيل نقل في وقت لاحق وتحديد المواقع من الكسب غير المشروع donnor.
- أخيرا ، تغطية التجمع مع مقلوب فالكون 35 مم طبق الثقافة.
2 : Explanting الجنين donnor في المياه المالحة
- فتح البويضة بواسطة التنصت على قذيفة بالملقط وإزالة قطعة من قذيفة ، في جميع أنحاء قذيفة. إزالة رأس قذيفة وتجاهل.
- إزالة ألبومين سميك بالملقط ، والميل كيس المح مع ملقط الخشنة بحيث الجنين يواجه صعودا.
- باستخدام مقص غرامة ، وقطع مربعة من الكيس المحي حول الجنين. إزالة الجنين من صفار البيض مع ملعقة ، والمكان في صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني.
- باستخدام الملقط ، فصل الجنين donnor الشفافة من المنطقة.
- donnor نقل الجنين الى صحن Sylgard مغطاة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
3 : وضع العلامات ، واستئصال وزرع donnor الكسب غير المشروع
- باستخدام مجتذب microelectrode ، وسحب 50 ميكرولتر microcapillary ماصات زجاجية. تحت المجهر ، وقطع غيض من micropipette باستخدام الملقط الغرامة. واصطف micropipette مكان في طبق بتري بشريط من plasteline.
- تحضير محلول الصبغة التي سيتم استخدامها لتسمية طعم قبل الزرع : carbocyanine الصبغة الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) : أولا ، إعداد وتقييم الجاذبة في 1ml المطلقة الإيثانول بنسبة 0.5 ٪. ويمكن تخزين هذا المخزون في دورتها الحادية و20C في الظلام. في حمام مائي وضعت في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 prewarmed مزيج الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى سكروز 0.3M 360μl. درجة حرارة مياه الاستحمام أمر ضروري من أجل منع ترسب الجاذبة وتشكيل بلورات غير قابلة للذوبان. تدور لفترة وجيزة على حل spectrafuge مصغرة (لثانية 5-10). الحل الجاذبة الآن جاهزة للاستخدام.
- باستخدام دبابيس الحشرات ، وتأمين donnor الجنين في أسفل الطبق Sylgard تغطيتها.
- العودة ملء micropipette مع الجاذبة. من خلال تطبيق ضغط لطيف باستخدام أنبوب التجميع الشافطة ، وتطبيق بلعة صغيرة من الجاذبة إلى عقدة هنسن. تأكد من تسمية كامل عقدة هنسن.
- باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، وقطع عقدة هنسن ("المنظم" ، donnor الكسب غير المشروع).
- علامة الجانب البطني ونهاية الخلفي من الكسب غير المشروع مع القرمز. وهذا ضمان أن يتم وضع الطعم مع التوجه السليم بطني ظهراني في الخطوة 4.3.
- باستخدام ماصة 200μl جيلسون ، ونقل والكسب غير المشروع إلى الجنين المضيف.
4 : تأمين الكسب غير المشروع وزرع الجنين المضيف
- إزالة الملوحة من الجنين المضيف ، والتأكد من الكسب غير المشروع لا يزال وضعه على مقربة من موقع المضيف.
- باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، إجراء شق صغير (80 100μm) في منطقة الشفافة / منطقة الحدود المنطقة المعتمة ، على مستوى عقدة هنسن من جنين المضيف.
- باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting الموقف ، والكسب غير المشروع بحيث يواجه الجانب البطني نحو لكم ونهاية الخلفي موازية لمنطقة ما يعادلها في الجنين المضيف.
- إزالة الملوحة المتبقية ، وعملية الجنين المضيف للثقافة الجديدة من أجل 81-22 ساعة (الخطوات 6،1-6،6 9).
- ثم يتم إصلاح الجنين المضيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الخطوات 7،1-7،7 9).
- تحت غطاء الدخان ، يعد حل DAB العاملة في تريس العازلة : ذوب الركيزة DAB (3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride) في تريس العازلة (100mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4) في 500μg/ml ؛ ابقاء الحل في الظلام ، وعلى الثلج.
- غسل الجنين مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 مليون مرة واحدة في كل وتريس العازلة لمدة 5 مليون سهم.
- نقل الجنين الى تجويف كوب الشريحة تحتوي على 1 مل تريس العازلة.
- استبدال الحل تريس العازلة مع 1.5 مل من محلول DAB. التخلص من غيض إيبندورف في دلو يحتوي على محلول التبييض 10 ٪ من أجل تطهير DAB. ساترة وضع على رأس الشريحة تجويف.
- تحت مضان (فلوريسئين ثيوسيانات) FITC ، والتركيز على الهدف من هذا المجهر على الكسب غير المشروع (الخلايا الحمراء سوف تظهر donnor الفلورسنت) وفضح لمضان FITC حتى جميع الخلايا الحمراء الفلورسنت أصبحت البني (وهذا يحدث نتيجة لالجاذبة ملون تألقي يجري photoconverted لبلورات البني غير قابلة للذوبان ، من خلال التعرض لموجة الإثارة FITC (488nm) في حضور DAB. تستغرق هذه العملية ما بين 20 مليون و 2 ساعة.
- بعد الانتهاء من رد الفعل photooxidation ، إزالة ساترة باستخدام الملقط الغرامة. نقل الجنين الى قارورة من الزجاج التلألؤ 20 مل تحتوي على PBTw (أو برنامج تلفزيوني مع 0.1 ٪ توين - 20).
- تنشيط DAB ساترة من تجويف والزجاج الشريحة التي تفرخ في محلول التبييض 10 ٪.
6 : عملية الجنين في الموقع عن التصوير الفوتوغرافي ، والتهجين وsectioning
- المضي قدما في الموقع التهجين (الخطوات 3،7-6،5 9) ، لاحتضان الجنين DIG المسبار المسمى فقط.
- المضي قدما في تصوير (8.2 الخطوة 9) وsectioning (الخطوات 8،3 8،4 و 9).
ممثل النتائج
في المثال التالي من مقايسة الحث العصبي ، يظهر طعم donnor لحث على التعبير عن أبتر من الأنسجة العصبية علامة المضيف مشتقة. في هذا المثال معينة ، قمنا بتقييم اكتساب القدرة على إحداث العصبية الجنينية في المناطق التي عادة لا يكون "منظم" قدرات : الكسب غير المشروع donnor تنبع من جنين التي كانت "منظم" منطقة ازالتها جراحيا من الجنين في مرحلة donnor 3 +. بعد التذرية ، لا يسمح للجنين لتطوير donnor في الثقافة الجديدة ، حتى ثقب تعافى وبنية تشبه عقدة هنسن وقد تشكلت. يسمى هذا الهيكل ثم مع صلاح الغيدان ، يستأصل من الجنين donnor والمطعمة على حدود المنطقة المعتمة الشفافة / منطقة جنين المضيف. التالية الثقافة الجديدة ، وتشكيل محور مصغرة المتاخمة لجنين المضيف : هذا المحور مصغرة تتكون من قضيب من خلايا الدم الحمراء (donnor المشتقة) وهيكل رأس مثل (المضيف المشتقة) : في الفقرة (أ) ، المشتقة من donnor الجاذبة المسمى وتظهر الخلايا قبل تثبيت تحت المجهر مضان FITC. وقد تكاثرت هذه الخلايا المشتقة من donnor لتشكيل notochord مصغرة ، والتي كما يبدو قضيب من خلايا الدم الحمراء. (ب) photoconversion عقب الجاذبة ، وهذه الخلايا المشتقة من donnor تظهر البني. والكسب غير المشروع الناجم donnor تشكيل الأنسجة العصبية من المضيف : هذا النسيج يتكون من السلائف للمخ ، كما يتضح من التعبير عنها ما يلي علامة أبتر التهجين في الموضع [طبع في الفترة من 6].
ملاحظة : في هذا الإجراء ، ونحن قد استخدمت خلايا الجاذبة المسمى من أجل التفريق الأنسجة العصبية donnor حمل (الأحمر / البني) مشتقة من المضيف "العصبية" الأنسجة (الأزرق). بدلا من استخدام كتكوت المشتقة ، صلاح الغيدان donnor الكسب غير المشروع المسمى ، وبعض الكتاب أيضا استخدام donnor الأنسجة المشتقة من الأجنة السمان بدلا من الفرخ [على سبيل المثال 6]. هذا أسلوب بديل يسمح أيضا للتمييز donnor من الأنسجة المضيف. في هذه الحالة ، والكسب غير المشروع (donnor الأنسجة) تنبع من بيض السمان بدلا من بيض الدجاج. الخطوة التالية هي حذف 4.5 ، يتم معالجة المضيف المناعية لتحميل كامل مع جسم معين إلى الأنسجة السمان (QCP1) والخطوات و3،1-3،4 5،1-5،7 من البروتوكول. ويرد مثال على هذا الإجراء البديل التالي : في هذه الحالة ، علينا استخدام نفس الإجراء التجريبي كما في ألف وباء ، ولكن كنا السمان المستمدة donnor الأنسجة (كما هو موضح من خلال التعبير عن الأضداد QCPN [البني]) : إن إعادة إحياء وقد يتسبب العقدة المستمدة من الأجنة السمان التعبير عن Sox2 علامة عموم العصبية في المضيف [طبع في الفترة من 6] :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في إجراء عملية فحص لتحريض العصبي ، ويستخدم هذا الاختبار أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ ، وبالتالي يمكن استخدامه لمجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات ، بدءا من micromanipulations الجنينى 1-4 ؛ 6 إلى شلالات جديدة كشف إشارات 7،8 ، وكلها تهدف إلى فهم الخطوة الأولى في تكوين الدماغ والجهاز العصبي المتبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
موانئ دبي هي المستفيدة من جائزة روث 1F32 - 01A1 كيرشتاين DA021977 من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
