Summary
Induzione neurale è il primo passo nella formazione del cervello. Si tratta di un meccanismo attraverso il quale nodo di Hensen (organizzatore), istruisce tessuti adiacenti ad adottare un destino neurale, cioè di dare origine al sistema nervoso. Questo video dimostra un test per l'induzione neurale in embrione di pollo.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare la formazione ed il modello iniziale del sistema nervoso. Questo video mostra come tessuto organizzatore innesto in un ospite, un metodo attraverso il quale nodo di Hensen s (l'organizzatore in embrione di pollo) si innesta in un ectoderma competente del paese ospitante. L'innesto organizzatore istruisce sovrastante na ve tessuto di adottare un destino neurale inducendo tramite segnali neurali. Questo meccanismo viene definito come l'induzione neurale, e costituisce il primo passo nella formazione del cervello e del midollo spinale in amnioti. Questo metodo è utilizzato essenzialmente per la caratterizzazione di molecole putativo neurale inducendo in pulcino. Questo video mostra le varie fasi del test per l'induzione neurale; In primo luogo, l'embrione è donnor espiantati e appuntato su un piatto. Poi, l'embrione host è pronto per la cultura Nuovo. L'innesto viene asportato e trapiantato nella zona pellucida margine ospite. L'host è in coltura per 18-22 ore. L'assemblea è fisso e trattati per le applicazioni più (ad esempio di ibridazione in situ). Questo metodo è stato originariamente ideato da Waddington
Protocol
I. Panoramica schematica:
Questo video mostra le varie fasi di analisi per l'induzione neurale in embrione di pollo. In primo luogo, l'embrione host è espiantati nella cultura New [NI1]. Poi, l'embrione è donnor espiantati in soluzione salina e nodo di Hensen (l '"organizzatore" in pulcino) è marcato con colorante fluorescente Dii [NI2]. Nodo di Hensen è asportato dall'embrione donnor [NI3] e trapiantati per l'embrione host [NI4, NI5]. L'embrione host è poi coltivate per un massimo di 22 ore, periodo dopo il quale il tessuto donnor ha indotto un asse ectopica nell'area ospite opaca [NI6]. In seguito la cultura, l'embrione host è fisso e trattati per fotoossidazione alla presenza del DAB: In questa reazione chimica, le cellule derivate donnor, che appaiono rossi sotto fluorescenza FITC prima fotoossidazione [NI7], diventano marroni seguente reazione con DAB [NI8]. L'embrione viene quindi elaborato per l'ibridazione in situ con un pennarello neurale [NI8]; tessuto ospite derivato si è formato tessuto neurale in presenza del trapianto donnor. Questo tessuto appare blu.
1: Preparare l'embrione di accoglienza per la cultura di New
- Questo protocollo di test di induzione neurale inizia con le uova che sono state incubate per Hamburger & Hamilton fase 3 + (o HH3 +). Queste uova sono state incubate previste dalla loro parte in un umido incubatore per 13 ore.
- Preparare l'embrione di accoglienza per la cultura Nuovo (passi 3.1. A 5.5 9).
- Coprire la superficie dell 'embrione ospite con 200 microlitri soluzione salina. Ciò faciliterà il trasferimento più tardi e il posizionamento dell'innesto donnor.
- Infine, comprende il montaggio con un piatto capovolto Falcon 35 millimetri cultura.
2: espianto l'embrione donnor in soluzione fisiologica
- Aprire l'uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere i pezzi del guscio, in tutto il guscio. Rimuovere superiore del guscio e scartare.
- Rimuovere l'albumina spessore con una pinza, e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che l'embrione verso l'alto.
- Utilizzando forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio, e mettere in un piatto contenente PBS.
- Utilizzando pinze, staccare l'embrione donnor da zona pellucida.
- Trasferimento donnor embrione di un piatto coperto Sylgard contenente PBS.
3: Etichettatura, asportare e trapiantare l'innesto donnor
- Utilizzando un estrattore microelettrodo, tirare 50 pipette di vetro microlitri microcapillare. Sotto il microscopio, tagliare la punta della micropipetta con una pinza sottile. Micropipetta posto in una capsula di Petri rivestito con un nastro di plasteline.
- Preparare la soluzione colorante che saranno utilizzati per etichettare l'innesto precedente al trapianto: carbocyanine colorante Dii (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato): in primo luogo, preparare uno stock di DII in 1 ml etanolo assoluto a 0,5%. Questo stock possono essere conservati a-20C nel buio. In un bagnomaria regolato a 42 ° C, mescolare preriscaldata 40 microlitri magazzino DII a 360μl 0.3M saccarosio. La temperatura del bagno l'acqua è necessaria per evitare la precipitazione di DII e la formazione di cristalli insolubili. In breve giro la soluzione su un spectrafuge mini (per 5-10 secondi). La soluzione DII è ora pronto all'uso.
- Utilizzando perni insetti, fissare l'embrione donnor sul fondo del piatto Sylgard coperto.
- Back-riempiono la micropipetta con DII. Applicando una leggera pressione con un gruppo del tubo aspiratore, applicare un piccolo bolo di DII al nodo di Hensen. Assicurarsi che l'intero nodo di Hensen è etichettato.
- Utilizzando una pipetta microcapillare o un coltello microdissecting, tagliare il nodo di Hensen ("organizzatore", innesto donnor).
- Contrassegnare il lato ventrale e la fine posteriore dell'innesto con carminio. Questo farà sì che l'innesto è posizionato con adeguata dorso-ventrale orientamento al punto 4.3.
- Usando una pipetta Gilson 200μl, trasferire l'innesto per l'embrione di accoglienza.
4: Garantire l'innesto e la coltura l'embrione ospite
- Rimuovere salina dall'embrione ospite, assicurandosi che il trapianto rimane posizionato in prossimità con il sito ospitante.
- Utilizzando una pipetta microcapillare o un coltello microdissecting, fare una piccola incisione (80-100μm) nella zona pellucida / area regione di confine opaca, a livello del nodo di Hensen di embrione di accoglienza.
- Utilizzando una pipetta microcapillare o un microdissecting coltello, la posizione in modo che l'innesto lato ventrale volti verso di voi e la fine posteriore è parallelo a regione equivalente in embrione ospitante.
- Rimuovere salina rimanenti, e l'embrione di processo host per nuova cultura per 81-22 ore (passi 6,1-6,6 9).
- L'embrione host è poi fissata la notte a 4 ° C (passi 7,1-7,7 9).
- Sotto cappa, preparare una soluzione DAB di lavoro in tampone Tris: Sciogliere substrato DAB (3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro) in Tris buffer (100mM Tris-HCl, pH 7,4) a 500μg/ml; tenere soluzione nel buio, sul ghiaccio.
- Lavare l'embrione due volte in PBS per 5 minuti ciascuno e una volta in tampone Tris per 5 mn.
- Trasferire l'embrione in una diapositiva cavità di vetro contenente 1 ml di tampone Tris.
- Sostituire la soluzione tampone tris con 1,5 ml di soluzione DAB. Smaltire Eppendorf punta nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10% per decontaminare DAB. Collocare un coprioggetto sopra scivolo cavità.
- Sotto FITC (isotiocianato di fluorescina) fluorescenza, messa a fuoco l'obiettivo del microscopio sul trapianto (cellule donnor apparirà rosso fluorescente) e di esporre a fluorescenza FITC fino a quando tutte le cellule fluorescenti rosse sono diventate marroni (questo accade a causa della DII fluorocromo essere photoconverted di cristalli insolubili marrone, con esposizione a lunghezza d'onda di eccitazione FITC (488 nm) in presenza del DAB. Questo processo richiede tra 20 minuti e 2 ore.
- In seguito al completamento della reazione fotoossidazione, rimuovere il coprioggetto utilizzando una pinza sottile. Il trasferimento di embrioni al vetro una fiala di scintillazione da 20 ml contenente PBTw (o PBS con 0,1% Tween-20).
- Disattivare DAB da coprioggetto e far scorrere cavità di vetro tramite l'incubazione in una soluzione di candeggina al 10%.
6: l'embrione di processo di ibridazione in situ, la fotografia e sezionamento
- Procedere con ibridazione in situ (passi 3,7-6,5 9), incubando l'embrione solo per DIG sonda marcata.
- Procedere con fotografare (passo 8,2 9) e sezionamento (punti 8.3 e 8.4 9).
Rappresentante Risultati
Nel seguente esempio di test di induzione neurale, l'innesto donnor è mostrato indurre l'espressione del marcatore Scudatu neurali derivate da tessuto ospite. In questo esempio particolare, abbiamo valutato l'acquisizione della capacità di indurre neurali delle regioni embrionale che normalmente non hanno "organizzatore" abilità: l'innesto donnor proviene da un embrione in cui la regione "organizzatore" è stato chirurgicamente rimosso dall'embrione allo stadio donnor 3 +. A seguito di ablazione, l'embrione donnor è permesso di sviluppare la cultura nuova, fino a quando il foro è guarito e una struttura simile a nodo di Hensen si è formata. Questa struttura è poi etichettato con DII, escisse dall'embrione donnor e innestati a zona pellucida / zona di confine opaca di un embrione di accoglienza. A seguito di nuova cultura, un asse in miniatura si forma adiacente l'embrione host: questo asse in miniatura è costituito da una verga di globuli rossi (donnor derivati) e una testa come la struttura (host derivati): In (A), donnor di derivazione DII etichetta le cellule vengono mostrati prima fissazione sotto FITC microscopia a fluorescenza. Questi donnor cellule derivate hanno proliferato a formare una miniatura notocorda, che appare come verga di globuli rossi. (B) fotoconversione seguito di DII, questi donnor cellule derivate dal appaiono marrone. L'innesto donnor ha indotto la formazione di tessuto neurale dall'host: questo tessuto è composto da precursori per il cervello, come rivelato da loro espressione per le seguenti marcatore Scudatu ibridazione in situ [ristampato da 6].
Nota: In questa procedura, abbiamo usato cellule Dii etichettati al fine di differenziare il tessuto neurale inducendo donnor (rosso / marrone) da host derivato tessuto "neurale" (blu). Invece di usare un pulcino deriva, Dii innesto etichettati donnor, alcuni autori anche l'uso dei tessuti donnor derivate da embrioni di quaglia al posto di pulcino [ad esempio 6]. Questo metodo alternativo permette inoltre di differenziare donnor dal tessuto ospite. In questo caso, l'innesto (tessuto donnor) nasce da uova di quaglia al posto delle uova di gallina. Seguendo passo 4.5, l'ospite viene elaborato per l'immunoistochimica montare tutto con un anticorpo specifico per quaglia tessuto (QCP1) e passi 3,1-3,4 e 5,1-5,7 vengono omessi dal protocollo. Un esempio di questa procedura alternativa è la seguente: In questo caso, abbiamo utilizzato la stessa procedura sperimentale come in A, B, ma abbiamo usato quaglia derivati tessuto donnor (come dimostra l'espressione di anticorpi QCPN [brown]): Il rigenerato nodo derivato da embrioni di quaglia ha indotto l'espressione del marcatore pan-neurale Sox2 nel paese ospitante [ristampato da 6]:
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Discussion
Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di un test per l'induzione neurale; Questo test è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione di molecole che inducono putativo neurali in pulcino, e quindi possono essere utilizzati per una vasta gamma di applicazioni, che vanno dalla micromanipolazioni embriologica 1-4; da 6 a svelare nuove cascate di segnalazione 7,8, tutti volti alla comprensione del primo passo nella formazione del cervello e del restante sistema nervoso.
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Acknowledgments
DP è destinatario del Premio Ruth Kirschstein DA021977 1F32-01A1 dal National Institute on Drug Abuse. Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
