Summary
Neural induktion är det första steget i bildandet av hjärnan. Det är en mekanism genom vilken Hensen nod (arrangör), instruerar kringliggande vävnad att anta ett neuralt öde, dvs att ge upphov till nervsystemet. Denna video visar en analys av neurala induktion i kycklingembryo.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera bildning och första anläggningen av nervsystemet. Denna video visar hur du ympa arrangör vävnad i en värd, en metod som Hensen s nod (arrangören i kycklingembryo) är ympade på en värd behörig ektoderm. Arrangören graft instruerar överliggande na har vävnad för att anta ett neuralt öde via neurala förmå signaler. Denna mekanism kallas neurala induktion, och utgör det första steget i bildandet av hjärnan och ryggmärgen i amnioternas. Denna metod är i huvudsak används för karakterisering av förmodade neurala förmå molekyler i chick. Denna video visar de olika stegen i analysen för neural induktion, det första är donnor embryot uttagna och fästs på ett fat. Sedan är värd embryot förberedd för ny kultur. Transplantatet är censurerade och transplanteras till värden området pellucida marginal. Värden är odlade på 18-22 timmar. Monteringen är fast och bearbetas för ytterligare tillämpningar (t.ex. in situ hybridisering). Denna metod var ursprungligen utformades av Waddington
Protocol
I. Schematisk översikt:
Denna video visar de olika stegen i analysen för neurala induktion i kycklingembryo. För det första är värd embryot explanterade i New kultur [NI1]. Sedan är det donnor embryot uttagna i koksaltlösning och Hensen nod (den "organisatör" i chick) är märkta med fluorescerande färg DII [NI2]. Hensen nod skärs från donnor embryot [NI3] och transplanteras till värden embryot [NI4, NI5]. Värden embryot är sedan odlas upp till 22 timmar, varefter period donnor vävnad har inducerade en ektopisk axel i den mottagande området opaca [NI6]. Efter kulturen är värd embryot fasta och bearbetas för fotooxidering i närvaro av DAB: Genom denna kemiska reaktion, donnor härledda celler, som visas röda under FITC-fluorescens före fotooxidering [NI7], bli brun följande reaktion med DAB [NI8]. Embryot bearbetas sedan för in situ hybridisering med ett neurala markören [NI8]; värd härrör vävnad har bildats nervvävnad i närvaro av donnor transplantat. Denna vävnad visas blått.
1: Förbereda värd embryot till ny kultur
- Detta neurala induktion analys protokoll börjar med ägg som har varit inkuberade till Hamburger & Hamilton steg 3 + (eller HH3 +). Dessa ägg har varit inkuberade lade på sin sida i en fuktig kuvös i 13 timmar.
- Förbered värd embryot till ny kultur (steg 3,1. 5,5 9).
- Täck ytan i den mottagande embryo med 200 l koksaltlösning. Detta kommer att underlätta senare överföring och placering av donnor transplantat.
- Slutligen omfattar församlingen med en inverterad Falcon 35 mm kulturen maträtt.
2: explantation de donnor embryo i saltlösning
- Öppna ägget genom att knacka på skalet med pincett och ta bort bitar av skalet runt skalet. Ta bort toppen av skalet och släng.
- Ta bort den tjocka albumin med pincett, och luta gulesäcken med grovt pincett så att embryot vänt uppåt.
- Använda fin sax, klippa en kvadrat med gulesäcken runt embryot. Ta bort embryot från äggulan med en sked och placera i en skål med PBS.
- Använd pincett, lossa donnor embryot från området pellucida.
- Överföring donnor embryo till en Sylgard täckta skålen med PBS.
3: märkning, excising och transplantera till donnor transplantat
- Använda en mikroelektrod avdragare, drar 50 l glas microcapillary pipetter. Under mikroskop, skär toppen av mikropipett med fin pincett. Placera mikropipett i en petriskål fodrad med ett band av plasteline.
- Förbered färglösningen som kommer att användas för att märka transplantatet före transplantation: carbocyanine dye DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat): Först, förbereda ett lager av DII i 1 ml absolut etanol på 0,5%. Detta lager kan förvaras vid-20C i mörker. I ett vattenbad inställd på 42 ° C, uppvärmd mix 40 l DII lager till 360μl 0,3 sackaros. Vattenbadet temperatur är nödvändig för att förhindra utfällning av DII och bildandet av olösliga kristaller. Kortfattat snurra lösningen på en mini spectrafuge (5-10 sekunder). Den DII Lösningen är nu klar att använda.
- Använda insekt stift, säkra donnor embryot på botten av den täckta Sylgard skålen.
- Back-fylla mikropipett med DII. Genom ett lätt tryck med hjälp av en församling aspirator röret, fäst ett litet bolus av DII till Hensen nod. Se till att hela Hensen nod är märkt.
- Med hjälp av en microcapillary pipett eller en microdissecting kniv, skär Hensen nod ("organisatör", donnor graft).
- Markera den ventrala sidan och bakre änden av transplantat med karmin. Detta kommer att säkerställa att transplantatet placeras med god Dorso-ventral riktning i steg 4,3.
- Med hjälp av en 200μl Gilson pipett transplantatet till värden embryot.
4: Säkra transplantat och odling värd embryot
- Ta bort saltlösning från värd embryo, och se till att transplantatet förblir placerade i närheten med värd platsen.
- Med hjälp av en microcapillary pipett eller en microdissecting kniv, gör ett litet snitt (80-100μm) i området pellucida / område opaca gränslandet, i nivå med Hensen nod av värd embryot.
- Med hjälp av en microcapillary pipett eller en microdissecting kniv, placera transplantat så att ventrala sidan är vänd mot dig och den bakre änden är parallell till motsvarande region i värd embryo.
- Ta bort resterande salt och bearbeta värd embryot till ny kultur för 81-22 tim (steg från 6,1 till 6,6 9).
- Värden embryot är sedan fast över natten vid 4 ° C (steg från 7,1 till 7,7 9).
- Enligt dragskåp, förbereda en DAB fungerande lösning i Tris-buffert: Lös DAB substrat (3,3 '-Diaminobenzidin tetrahydrochloride) i Tris-buffert (100 mm Tris-HCl, pH 7,4) vid 500μg/ml, hålla lösning i mörkret, på is.
- Tvätta embryot två gånger i PBS för 5 MN var och en gång i Tris-buffert i 5 minuter.
- Överför embryo till ett glas hålighet bild innehåller 1 ml Tris-buffert.
- Byt Trisbuffert lösning med 1,5 ml DAB-lösning. Kasta Eppendorf spets i hink med en 10% blekmedel lösning för att sanera DAB. Sätt på ett täckglas ovanpå hålighet bild.
- Enligt FITC (fluoresceinisothiocyanat) fluorescens, fokus syftet med mikroskop på transplantat (donnor celler visas fluorescerande röd) och utsättas för FITC-fluorescens tills alla fluorescerande röda celler har blivit brun (detta sker som ett resultat av DII fluorokrom som photoconverted till olösliga bruna kristaller, genom exponering för FITC excitationsvåglängden (488nm) i närvaro av DAB. Denna process tar mellan 20 min och 2 timmar.
- Efter slutförandet av fotooxidering reaktion, ta bort täckglas med fin pincett. Överföring embryo till glas en 20 ml scintillation flaska innehållande PBTw (eller PBS med 0,1% Tween-20).
- Inaktivera DAB från täckglas och glas hålighet glida genom inkubering i 10% blekmedel.
6: Process embryot för in situ hybridisering, fotografering och sektionering
- Fortsätt med in situ hybridisering (steg från 3,7 till 6,5 9), inkubera embryot för endast DIG märkt sond.
- Fortsätt med fotografering (steg 8,2 9) och sektionering (steg 8,3 och 8,4 9).
Representativa resultat
I följande exempel av neurala induktion analys är donnor transplantat visat inducera uttryck för den neurala markören svanslösa från värden härledda vävnad. I just detta exempel bedömde vi förvärvet av neurala förmå förmåga embryonala regioner som normalt inte har "organisatör" förmågor: den donnor transplantat kommer från ett embryo där "organisatör" regionen har opererats bort från donnor embryot på scen 3 +. Efter ablation är donnor embryot tillåts utvecklas i New kultur, tills hålet har läkt och en struktur som liknar Hensen nod har bildats. Denna struktur är då märkt med DII, utskurna ur donnor embryot och ympade till område pellucida / område opaca gränsen av en värd embryo. Följande nya kulturen, är en miniatyr axel som bildas i anslutning till värden embryot: denna miniatyr axel består av en stav av röda blodkroppar (donnor härstammar) och ett huvud-liknande struktur (host härledda): I (A), donnor-derived DII märkt cellerna visas innan fixeringen i FITC-fluorescens mikroskopi. Dessa donnor som härrör celler har frodats att bilda en miniatyr notochord, som visas som spö av röda blodkroppar. (B) Efter photoconversion av DII, dessa donnor-derived celler, tycks brun. Den donnor graft har lett bildandet av nervvävnad från värden: denna vävnad består av prekursorer för hjärnan, vilket framgår av deras uttryck för markören svanslösa följande in situ hybridisering [omtryckt från 6].
Anm: I detta förfarande har vi använt DII märkta celler för att skilja neurala förmå donnor vävnad (röd / brun) från värd härledas "neural" vävnad (blå). Istället för att använda en brud kommer, DII märkt donnor transplantat, vissa författare använder även donnor vävnad från vaktel embryon istället för chick [t.ex. 6]. Denna alternativa metod gör det också möjligt att skilja donnor från värd vävnad. I detta fall har sitt ursprung transplantatet (donnor vävnad) från vaktelägg istället för kyckling ägg. Efter steg 4,5, är värd behandlas för hela montera immunohistokemi med en antikropp specifik för vaktel vävnad (QCP1) och steg från 3,1 till 3,4 och från 5,1 till 5,7 utelämnas från protokollet. Ett exempel på detta alternativa förfarandet visas nedan: I detta fall använde vi samma experimentella procedur som i A, B, men vi använde vaktel-derived donnor vävnad (vilket framgår av uttrycket av QCPN antikroppar [brun]): Den regenererade nod från vaktel embryo har lett ett uttryck för hela neurala markören Sox2 i värden [omtryckt från 6]:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar de olika stegen för att utföra ett test för neural induktion; Denna analys är i huvudsak används för karakterisering av förmodade neurala förmå molekyler i chick, och därmed kan användas för en mängd olika tillämpningar, från embryologiska micromanipulations 1-4; 6 att reda nytt signalsystem kaskader 7,8, som syftar till förståelse av det första steget i bildandet av hjärnan och övriga nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DP är mottagare av Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 från National Institute on Drug Abuse. Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Micr–lectrode puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
