Summary
このビデオでは、マウス脾細胞の単細胞懸濁液を準備するためにgentleMACSのDissociatorを使用して自動化された組織の解離のためのシンプルな、時間の節約テクニックを説明します。
Abstract
単細胞懸濁液は、細胞分離、細胞解析と細胞培養の実験のための前提条件です。退屈でしばしば痛みを伴うマニュアルの解離を避けるためにgentleMACSのDissociatorは1つが制御され、再現可能な条件の下で非常に効率的に組織を解離することができます。 gentleMACSのDissociatorは、最適に、ユーザーの安全と時間節約と標準化を組み合わせ、マウスの脾臓を切り離すことができます。このビデオでは、gentleMACS Dissociator、機械的に生存細胞懸濁液を生成するために特殊なチューブを使用して組織を混乱させることができる自動化された卓上型の装置を使用してマウスの脾臓を解離させる方法について説明します。解離に続いて、脾臓を、ろ過、遠心分離し、さらにアプリケーション用に再懸濁する。
Protocol
機器の紹介
- 組織は、実行可能な単細胞懸濁液に紫のC管を使用して、穏やかに解離している。
- PBS / BSA EDTAバッファーは細胞を解離するために使用されます。バッファーは、EDTAを含む溶液をすすぎautoMACSの20部にBSAのストック溶液の1部を添加して調製される。
- MACSプレセパレーションフィルターは、解離組織サンプルが正常に行わMACS分離とその後の分析を促進する、すべての細胞塊がないかようにするために使用されます。
脾臓細胞を解離
- 全体脾臓をgentleMACSのDissociatorを使用して脾細胞の単細胞懸濁液にdisscociatedされています。
- 手順を開始するには、脾臓の質量に応じてバッファーの量とCチューブをロードする。若年成人女性のBALB / cマウスの健康な脾臓は80から120まで約10mgの重量を量る。この質量の1〜2脾臓は、緩衝液3mlを必要とする。感染症のある高齢の動物または動物から脾臓はしばしば大きく、バッファに検討する必要があります。バッファのボリュームは、それに応じてスケーリングする必要があります。を10mLの総バッファ量を超えないようにしてください。
- 緩衝液3mlを含むCチューブに切除した脾臓を追加。
- Cチューブのキャップがタイトであることを確認して、上下のキャップでdissociatorにCチューブを取り付けます。
- dissociatorの電源を入れます。 1から2脾臓の場合は、プログラムのm_spleen_01を選択します。プログラムが完了するまで56秒かかります。脾臓の数が大きい場合は、プログラムm_spleen_04を使用して、このプログラムは、脾臓の組織の最大720 mgのために使用することができます。
- プログラムの終了後、ネイティブの脾臓の組織では、脾臓細胞懸濁液中に解離している。
- 約30秒間室温で300xgで全細胞懸濁液をスピンダウン。これは、回転子と固定子は、C管の下部に収集されるすべてのセルから解放されることを保証します。
- 1000年マイクロリットルピペッターを使用してC管のキャップにセプタムシール開口部を通してサンプルを削除します。
濾過のステップ
- 濾過工程を開始するには、プレセパレーションフィルターまたは30μmの孔径を持つセルストレーナーに解離組織を適用する。ストレーナーは1-2脾臓または2つ以上の脾臓では50 mLのチューブに15 mLのチューブを適合する必要があります。
- 細胞懸濁液が通過してみましょう。その後、緩衝液5 mLを適用することにより、フィルターを洗う。
- 今、脾臓細胞ペレットにすべての脾細胞を収集するために室温で10分間、300xgで細胞懸濁液でチューブを遠心する。
- 今、我々は解離脾細胞のペレットを持っていることを、我々は、上清を吸引除去し、バッファの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します必要があります。
gentleMACSのDissociatorを使用して、脾臓の解離は、MACSQuant Analyzerを使用してフローサイトメトリーによって実証されている実行可能な脾細胞の割合が高いが、得られます。死んだ細胞はヨウ化プロピジウムで染色されています。提供される例では、前方側方散乱ドットプロットでは、調製した脾細胞を示しています。
Discussion
退屈でしばしば痛みを伴うマニュアルの解離を避けるために、gentleMACSのDissociatorは1つが制御され、再現可能な条件の下で非常に効率的に組織を解離することができます。組織解離の手順は、高い生存率と細胞と収量の細胞懸濁液に優しいです。 Cチューブとの組み合わせでgentleMACSのDissociatorは、様々な組織からの単細胞懸濁液の調製のために設計されています。楽器は、マウスの脾臓、肝臓、肺、または神経組織を解離するためにあらかじめ設定されたプログラムの数が装備されています。プログラムとプロトコルの範囲は連続して追加の組織を含むように拡張されます。
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS™ Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx |
| 13 mL Tubes | Miltenyi Biotec | 130-091-596 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx |
| autoMACS™ Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx |
| MACS® BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
| Propidium Iodide Solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
