Summary
交付的外科手术胚胎干细胞衍生的内皮细胞缺血后肢证明非侵入性的生物发光成像跟踪，
Abstract
外周动脉疾病（PAD）的供应含氧的血液和养分的腿和脚的外周动脉狭窄的结果，这一病理原因，如间歇性跛行（行走疼痛），缺血性溃疡的痛苦，甚至危及肢体坏疽等症状。人们普遍认为，血管内皮细胞，投资的所有血液和淋巴管的管腔表面的内皮细胞单层，起着主导作用，在血管稳态和血管再生。因此，干细胞为基础的血管内皮细胞的再生，可能是一种用于治疗垫有前途的方法。
在这段视频中，我们展示了移植的胚胎干细胞（ESC）上衍生的内皮细胞单方面hindimb缺血的治疗PAD的模式，由非侵入性的跟踪细胞归巢和生物发光成像的生存。将描述细胞的交付和成像的具体材料和程序。此协议如下描述Niiyama等肢体缺血诱导的其他出版物。
Protocol
1。小鼠胚胎干细胞分化成内皮细胞
- 胚胎干细胞分化成内皮细胞的协议是在别处描述，是不是本议定书的重点2,3。简单地说，允许细胞分化，如CD31或血管内皮细胞钙粘蛋白（VE - cadherin的）的内皮标记阳性的细胞，然后通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化。
2。建设双融合报告基因的慢病毒转导
- 生物发光，可用于跟踪修改，以表达如萤火虫荧光素酶（fluc）记者基因的细胞。对于这种应用，我们的细胞中含有内部ubiquitin启动子的控制下fluc和增强绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因。为了修改细胞，转基因的慢病毒载体，包含优化的关键基因元素，以满足生物安全标准，以及增加转染效率，PFU - FG载体，在我们携带fluc - EGFP融合报告基因的实验室开发的可用于稳定转导后的细胞分化。这种融合构建，使移植细胞的生物发光和荧光跟踪。产生的病毒颗粒，表达报告基因标记，是其他地方4所描述的细胞转导和生产的过程。
3。缺血后肢移植ESC衍生的内皮细胞
- 开始准备一个已经发生了肢体缺血细胞移植的小鼠的过程。要做到这一点，放入含有1-3％，在100％的氧气，在流速为1L/min时异氟醚麻醉诱导室的鼠标。
- 留在鼠标感应室，直到它是对外界刺激的反应迟钝。然后从动物感应室。
- 然后，在仰卧位放置动物上了手术台，并把它连接到一个连续流动的1-3％，100％的氧气，在流速为1L/min时异氟醚。
- 用后肢的皮肤有三个交替优碘和酒精擦洗。
- 一旦皮肤清洁，获得一百万ESC - 衍生的内皮细胞在30μL磷酸盐缓冲液（PBS）。这些细胞装入一个28号针头。
- 当细胞准备好后，轻轻提起，并延长后肢腓肠肌的位置，以更好地可视化。虽然腿延长，经皮肤插入到底层的肌肉针。小心不要接近骨。轻轻地，慢慢地注入腓肠肌30μL细胞的混合物。对于肌肉注射，30μL体积的限制，可以注射。因此，28号胰岛素注射器的首选，因为在我们的经验，他们消除在注射器针头的损失量。
- 注射完成后，返回鼠标的回收笼，并连续监测，直到清醒。让动物恢复了几个小时，然后进行移植的细胞在体内的生物发光成像。
4。 ESC体内的内皮细胞的生物发光成像
- 移植ESC衍生endothelials细胞进行了修改，同时表达fluc和内部ubiquitin启动子的控制下的EGFP融合基因。因此，生物发光，可用于跟踪的细胞在缺血后肢。
- 要开始这一步，打开的生物发光成像系统和生活的图像采集软件。然后初始化采集系统和指定的视野尺寸。
- 下一步，放置到成像中吸收的背景排放的黑色磨砂纸。
- 一旦成像盒已准备就绪，放入1L/min时输出含有1-3％的氧异氟醚麻醉诱导室鼠标。留在鼠标感应室，直到它是对外界刺激的反应迟钝。然后从动物感应室。
- 删除从两个后肢必要时使用电动剃须刀的头发。
- 进入腹膜，每克体重注入10μL的D -荧光素。在D -荧光素是提前做好准备，到15毫克/毫升的PBS筛选股票的解决方案。
- 一旦注入荧光素，放入成像盒连接到一个异氟醚的连续流动，在仰卧位的黑纸的动物。
- 动物放入成像盒和连接到异氟醚。
- 开始获得10-60秒的图像，以确定最佳的曝光时间，图像是不饱和。如果图像趋于饱和，减少曝光时间。如果生物发光信号非常弱，增加曝光时间。
- Usin克获得最佳曝光时间，继续收购图片每隔1-3分钟，直到信号达到最大值，然后淡出。收购完成后，保存文件。
- 对数据进行分析，选择感兴趣的区域（投资回报），包括注射部位。作为阴性对照，类似的投资回报率可以选择非经营腿。使用该软件，测量光子/秒/厘米2 /球面度（P / S /厘米2 / SR）为单位表示，这是总的光芒，为每个时间点的投资回报。最大的价值应该在最终的数据。数据也可以导出到Excel电子表格供日后使用。
- 一旦获得的所有数据，返回的动物恢复笼和监测不断，直到动物醒来。
- 重复此过程，随着时间的推移跟踪细胞。
- 在所需的时间点，动物可以安乐死评估组织的功能。
5。代表性的成果
一个移植的细胞在缺血性左后肢代表的生物发光的图像如图1所示。在生物发光的收购，强度将随时间增加，日久期间取得的最大值应作为报告的最终值。
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Discussion
胚胎干细胞是一个有前途的治疗，因为它们的分化和给自己的能力上升到包括所有三个胚层，包括血管内皮细胞的细胞谱系的可塑性组织缺血的细胞来源。为了克服与胚胎干细胞相关的伦理问题，诱导多能干细胞（iPS细胞）的可替代的多能干细胞的来源，克服的伦理问题。除了胚胎干细胞，还可以用于如内皮祖细胞（EPCs）和造血干细胞（HSCs）的成体干细胞，但这些细胞类型可能与PAD患者的治疗效果有限。细胞肌内交付是微创，易于操作，这种交付模式也可以交付可溶性因子或质粒。然而，股动脉或尾静脉血管，进入全身交付移植的细胞更容易的访问可以被用来代替肌肉注射。
生物发光成像提供高吞吐量和非侵入性的细胞存活的跟踪执行的优势。当与功能分析，如激光多普勒血流灌注或新生血管的组织学分析相结合，这些技术可以让研究人员，以评估细胞移植治疗肢体缺血的恢复作用。
总之，我们已经证明了一个简单，重复性好方法治疗肢体缺血的ESC衍生的内皮细胞的交付和跟踪。
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Acknowledgments
作者感谢安德烈阿克斯特尔，伊藤聪，MD，杰夫Velotta，医学博士，格兰特霍伊特，罗伯特C ·罗宾斯博士，金钰，医学博士，添多伊尔，博士和斯坦福大学的小动物成像核心技术援助。作者还感谢支持兽医设备AM比克福德公司。支持这项研究是由美国国立卫生研究院的研究补助金（R01 HL - 75774，R01，R21 HL085743，CA098303 1K12 HL087746），加利福尼亚州烟草相关疾病的研究计划的加州大学（15IT - 0257和1514RT - 0169） ，并为加州再生医学（RS1 - 00183）研究所。
新罕布什尔州是支持由美国心脏协会的奖学金。心脏协会。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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