Summary
La procedura chirurgica per la consegna delle cellule staminali embrionali derivate le cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico è dimostrato, con il monitoraggio non invasivo per l'imaging bioluminescenza.
Abstract
Malattia arteriosa periferica (PAD) è il risultato restringimento delle arterie periferiche che forniscono sangue ossigenato e sostanze nutritive alle gambe e ai piedi, questa patologia provoca sintomi come la claudicatio intermittente (dolore con piedi), dolorose ulcerazioni ischemiche o addirittura pericolose per la gangrena degli arti. Si ritiene generalmente che l'endotelio vascolare, un monostrato di cellule endoteliali che investe la superficie luminale di tutti i vasi sanguigni e linfatici, gioca un ruolo dominante nell'omeostasi vascolare e la rigenerazione vascolare. Di conseguenza, a base di cellule staminali rigenerazione dell'endotelio può essere un approccio promettente per il trattamento PAD.
In questo video, dimostriamo il trapianto di cellule staminali embrionali (ESC)-derivate cellule endoteliali per il trattamento di ischemia unilaterale hindimb come modello di PAD, seguita da monitoraggio non invasivo di homing delle cellule e della sopravvivenza attraverso l'immagine bioluminescenza. I materiali e procedure specifiche per la consegna delle cellule e di imaging verranno descritte. Questo protocollo segue un'altra pubblicazione che descrive l'induzione di ischemia degli arti posteriori da Niiyama et al 1.
Protocol
1. Differenziazione dei CES murino in cellule endoteliali
- Il protocollo per la differenziazione in cellule endoteliali CES è descritto altrove e non è il focus di questo protocollo 2,3. In breve, le cellule possono differenziarsi, e le cellule che sono positivi per i marcatori endoteliali come CD31 o caderina vascolare endoteliale (VE-caderina) sono poi purificata mediante fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS).
2. La costruzione del gene doppia Reporter fusione e trasduzione lentivirali
- Bioluminescenza può essere utilizzato per monitorare le cellule che vengono modificate per esprimere geni reporter come la lucciola luciferasi (fluttuazioni). Per questa applicazione, le nostre cellule contengono sia fluttuazioni e migliorato proteina verde fluorescente (eGFP) del gene di fusione sotto il controllo di un promotore interno ubiquitina. Al fine di modificare le cellule, il vettore transgene lentivirale contenente elementi chiave ottimizzate genetica per soddisfare i criteri di bio-sicurezza e una maggiore efficienza di trasduzione, PFU-FG vettore sviluppate nel nostro laboratorio portando la fluttua-eGFP gene reporter di fusione può essere utilizzata per stabilmente trasdurre le cellule dopo la differenziazione. Questo costrutto fusione permette sia bioluminescenza e il monitoraggio fluorescenza delle cellule trapiantate. La procedura per la generazione di particelle virali, la trasduzione e la produzione di cellule marcate che i geni reporter di esprimere è descritto altrove 4.
3. Il trapianto di ESC-derivato cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico
- Avviare la procedura di preparazione di un topo che ha subito l'ischemia degli arti posteriori per il trapianto di cellule. Per fare questo, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min.
- Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
- Poi, posto l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio e collegarlo a un flusso continuo di 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min.
- Pulire la pelle del arti posteriori con tre scrub alternati Betadine e alcol.
- Una volta che la pelle è pulita, ottenere milione ESC-derivato cellule endoteliali in 30 ml di tampone fosfato (PBS). Carico di queste cellule in un ago calibro 28.
- Quando le cellule sono pronte, sollevare delicatamente ed estendere le arti posteriori per visualizzare meglio la posizione del muscolo gastrocnemio. Mentre la gamba si apre, inserire l'ago attraverso la pelle nel muscolo sottostante. Fare attenzione a non avvicinarsi alle ossa. Delicatamente e iniettare lentamente il composto 30 microlitri di cellule nel gastrocnemio. Per iniezione intramuscolare, 30 microlitri è vicino al limite di volume che può essere iniettato. Pertanto, 28-indicatore di siringhe da insulina sono preferiti perché, nella nostra esperienza, eliminano il volume di perdita di aghi di siringa.
- Dopo l'iniezione è completa, ritorno il mouse per la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando sveglio. Permettere agli animali di recuperare per diverse ore e poi procedere con l'imaging bioluminescenza in vivo delle cellule trapiantate.
4. L'imaging bioluminescenza CES derivate cellule endoteliali in vivo
- Il trapiantato ESC cellule derivate endothelials sono stati modificati per esprimere sia l'fluttuazioni e il gene di fusione eGFP sotto il controllo di un promotore interno ubiquitina. Pertanto, la bioluminescenza può essere utilizzato per tenere traccia delle celle all'interno degli arti posteriori ischemico.
- Per iniziare questo passaggio, attivare il sistema di imaging bioluminescenza e Immagine Living software di acquisizione. Poi inizializzare il sistema di acquisizione e specificare le dimensioni del campo visivo.
- Successivamente, la carta nera opaca posto sulla scatola di imaging per assorbire le emissioni di fondo.
- Una volta che la casella di imaging è pronto, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno in uscita di 1L/min. Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
- Rimuovere i capelli da entrambi zampe posteriori con un rasoio elettrico, se necessario.
- Iniettare 10 ml di D-luciferina per grammo di peso corporeo nel peritoneo. Il D-luciferina è preparato in anticipo in soluzioni stock filtrato di 15 mg / ml in PBS.
- Una volta che la luciferina viene iniettato, posto l'animale nella casella di immagine sulla carta nera in posizione supina, collegato ad un flusso continuo di isoflurano.
- Posizionamento animali nella casella di imaging e il collegamento a isoflurano.
- Avvio di acquisire le immagini per 10-60 secondi al fine di determinare un momento ottimale di esposizione per cui l'immagine non è saturo. Se l'immagine si satura, ridurre il tempo di esposizione. Se il segnale di bioluminescenza è molto debole, aumentare il tempo di esposizione.
- Using il tempo di esposizione ottimale, continuare l'acquisizione di immagini ogni 1-3 minuti fino a quando il segnale raggiunge il massimo e poi svanisce. Quando l'acquisizione è stata completata, salvare il file.
- Per analizzare i dati, selezionare le regioni di interesse (ROI) che coprono il sito di iniezione. Come controllo negativo, un ROI simile può essere selezionato per il non-operato gamba. Utilizzando il software, misurare la luminosità totale, che è espressa in unità di fotoni / secondo / cm 2 / steradiante (p / s / cm 2 / sr), per il ROI per ogni timepoint. Il valore massimo deve essere utilizzato nei dati finali. I dati possono anche essere esportati in Excel per un uso futuro.
- Una volta che tutti i dati sono acquisiti, rispedire l'animale verso la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando il risveglio degli animali.
- Ripetere questa procedura per monitorare le cellule nel tempo.
- Ad un certo punto di tempo desiderato, l'animale può essere eutanasia per la valutazione della funzione dei tessuti.
5. Rappresentante Risultati
Un'immagine bioluminescenza rappresentante delle cellule trapiantate nella sinistra ischemica degli arti posteriori è mostrata in Figura 1. Durante l'acquisizione di bioluminescenza, l'intensità aumenta con il tempo, e il valore massimo ottenuto durante il periodo di tempo devono essere segnalati come il valore finale.
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Discussion
CES sono una fonte di cellule promettente per il trattamento di ischemia del tessuto a causa della loro plasticità di differenziazione e la loro capacità di dare origine a linee cellulari che comprende tutti e tre i foglietti embrionali, comprese le cellule endoteliali. Per superare le questioni etiche associate con i CES, cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) può essere un'alternativa fonte di staminali pluripotenti cella che supera i problemi etici. Oltre a CES, le cellule staminali adulte, come le cellule progenitrici endoteliali (EPC) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC) può anche essere usato, ma questi tipi di cellule possono avere limitato effetto terapeutico nei pazienti con PAD. Consegna intramuscolare di cellule è minimamente invasiva e facile da eseguire, e questo modo di consegna è anche riconducibile alla consegna di fattori solubili o plasmidi. Tuttavia, per facilitare l'accesso delle cellule trapiantate per la vascolarizzazione, la consegna sistemica nell'arteria femorale o vena coda può essere usato al posto di iniezioni intramuscolari.
Di imaging bioluminescenza offre il vantaggio di effettuare il monitoraggio high-throughput e non invasivo della sopravvivenza cellulare. Se combinato con test funzionali quali la perfusione sanguigna laser Doppler o analisi istologica di neovascolarizzazione, queste tecniche insieme possono permettere ai ricercatori di valutare l'effetto terapeutico del trapianto di cellule sul recupero di ischemia degli arti posteriori.
In conclusione, abbiamo dimostrato un metodo semplice e riproducibile per la distribuzione e il monitoraggio di ESC-derivate cellule endoteliali per il trattamento di ischemia degli arti posteriori.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e lo Small Animal Imaging Stanford Nucleo per l'assistenza tecnica. Gli autori hanno anche ringraziare AM Bickford, Inc. per il supporto di attrezzature veterinarie. Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca dal National Institutes of Health (R01 HL-75774, CA098303 R01, R21 HL085743, 1K12 HL087746), il tabacco California sul programma di ricerca sulle malattie della University of California (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e l'Istituto di Medicina Rigenerativa della California (RS1-00183).
NH è sostenuto da una borsa di studio della American Heart Association. può Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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