Summary
Das chirurgische Verfahren für die Lieferung von embryonalen Stammzellen abgeleitete Endothelzellen der ischämischen Hinterlauf gezeigt wird, mit nicht-invasive Tracking durch Biolumineszenz-Bildgebung.
Abstract
Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ergibt sich aus Verengung der peripheren Arterien, die sauerstoffreiches Blut und Nährstoffen zu versorgen, um die Beine und Füße, Ursachen dieser Erkrankung Symptome wie Claudicatio intermittens (Schmerzen beim Gehen), schmerzhafte ischämische Geschwüre oder sogar Gliedmaßen-bedrohlichen Gangrän. Es wird allgemein angenommen, dass das vaskuläre Endothel, einer Monoschicht aus Endothelzellen, die der luminalen Oberfläche von Blut-und Lymphgefäße investiert, eine dominierende Rolle spielt in der vaskulären Homöostase und vaskuläre Regeneration. Als Ergebnis Stammzellen-basierten Regeneration des Endothels kann ein viel versprechender Ansatz zur Behandlung von PAD werden.
In diesem Video zeigen wir die Transplantation von embryonalen Stammzellen (ESC)-abgeleiteten Endothelzellen zur Behandlung von einseitigen hindimb Ischämie als ein Modell der PAD, durch nicht-invasive Verfolgung der Zelle Homing und das Überleben von Biolumineszenz-Bildgebung verfolgt. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Zell-Liefer-und Imaging beschrieben. Dieses Protokoll folgt eine weitere Veröffentlichung in der Beschreibung der Induktion der hinteren Gliedmaßen Ischämie durch Niiyama et al. 1
Protocol
1. Differenzierung von murinen ES-Zellen in Endothelzellen
- Das Protokoll zur Differenzierung von ES-Zellen in Endothelzellen wird an anderer Stelle beschrieben ist nicht der Schwerpunkt dieses Protokoll 2,3. Kurz gesagt, werden die Zellen erlaubt, zu unterscheiden, und die Zellen, die positiv für die endotheliale Marker wie CD31 oder vascular endothelial cadherin (VE-Cadherin) werden dann mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) gereinigt.
2. Der Bau des Double Fusion Reporter Gene und Lentivirale Transduktion
- Biolumineszenz kann verwendet werden, um Zellen, die geändert werden, um Reporter-Gene wie Glühwürmchen-Luciferase (fluc) exprimieren, sind zu verfolgen. Für diese Anwendung enthalten unsere Zellen sowohl Schwankungen und verbesserte grün fluoreszierendes Protein (eGFP) Fusionsgen unter der Kontrolle eines internen Ubiquitin-Promotor. Um die Zellen zu verändern, das Transgen lentiviralen Vektor, der Schlüssel optimiert genetische Elemente zu erfüllen bio-Sicherheitskriterien sowie erhöhte Transduktionseffizienz kann PFU-FG-Vektor in unserem Labor Durchführung der Schwan-eGFP Fusion Reportergens entwickelt, um stabil zu werden Transduktion der Zellen nach Differenzierung. Diese Fusionskonstrukt ermöglicht sowohl Biolumineszenz und Fluoreszenz-Tracking der transplantierten Zellen. Das Verfahren zur Erzeugung von Viruspartikeln, Transduktion und Produktion von markierten Zellen, die zum Ausdruck Reportergene anderswo 4 beschrieben.
3. Die Transplantation von ESC-derived Endothelzellen der ischämischen Hinterlauf
- Beginnen Sie den Vorgang, indem man eine Maus, die hinteren Gliedmaßen Ischämie für die Zell-Transplantation unterzogen wurde. Dazu platzieren Sie den Mauszeiger in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min.
- Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer.
- Dann setzen Sie das Tier in Rückenlage auf dem OP-Tisch und verbinden Sie es mit einem kontinuierlichen Strom von 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min.
- Wischen Sie die Haut der hinteren Gliedmaßen mit drei wechselnden betadine und Alkohol scheuert.
- Sobald die Haut wird gereinigt, erhalten eine Million ESC-derived Endothelzellen in 30 ul Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie diese Zellen in einer 28-Gauge-Nadel.
- Wenn die Zellen bereit sind, heben und erweitern das Hinterbein besser visualisieren die Position des M. gastrocnemius. Während die Bein ist gestreckt, die Nadel durch die Haut in das darunter liegende Muskulatur. Achten Sie darauf, nicht bis auf die Knochen Ansatz. Sanft und langsam injizieren die 30 ul Zelle Mischung in die gastrocnemius. Für die intramuskuläre Injektion von 30 ul in der Nähe der Grenze von Volumen, das injiziert werden können. Daher sind 28-gauge Insulinspritzen bevorzugt, weil nach unserer Erfahrung, sie den Verlust Volumen in Spritzen-Nadeln zu beseitigen.
- Nach der Injektion abgeschlossen ist, kehren die Maus, um die Erholung Käfig und überwachen sie kontinuierlich bis wach. Lassen Sie das Tier für mehrere Stunden erholen und fahren Sie dann mit der in vivo Biolumineszenz-Bildgebung der transplantierten Zellen.
4. Biolumineszenz-Bildgebung des ESC-derived Endothelzellen in vivo
- Die transplantierten ESC-derived Endothelzellen Zellen wurden modifiziert, um sowohl die Schwankungen und die eGFP-Fusionsgen unter der Kontrolle eines internen Ubiquitin-Promotor auszudrücken. Daher kann Biolumineszenz verwendet werden, um die Zellen innerhalb der ischämischen Hinterlauf zu verfolgen.
- Zu Beginn dieses Schrittes auf die Biolumineszenz-Bildgebung und Wohnen Bildaufnahme-Software ab. Dann initialisieren den Erwerb und die Maße des Gesichtsfeldes.
- Als nächstes legen Sie schwarze matte Papier auf die Bildgebung Feld Hintergrund-Emissionen zu absorbieren.
- Sobald die Bildgebung Kiste ist fertig, legen Sie die Maus in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in Sauerstoff am Ausgang des 1l/min. Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer.
- Entfernen Sie das Haar von beiden Hinterbeine mit einem elektrischen Rasierer wie nötig.
- Inject 10 l D-Luciferin pro Gramm Körpergewicht in die Bauchhöhle. Die D-Luciferin ist im Voraus zu gefiltert Stammlösungen von 15 mg / mL in PBS hergestellt.
- Sobald das Luciferin injiziert wird, legen Sie das Tier in der Imaging-Box über das schwarze Papier in der Rückenlage, verbunden mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran.
- Platzieren Tier in Imaging-Box und die Verbindung mit Isofluran.
- Start, um Bilder für 10-60 Sekunden zu erwerben, um eine optimale Belichtungszeit für die das Bild nicht gesättigt ist zu bestimmen. Wenn das Bild gesättigt, reduzieren Sie die Belichtungszeit. Wenn die Biolumineszenz-Signal ist sehr schwach, erhöhen Sie die Belichtungszeit.
- Using die optimale Belichtungszeit, weiterhin den Erwerb Bilder alle 1-3 Minuten, bis das Signal das Maximum erreicht und dann verschwindet. Wenn Akquisition abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei.
- Um die Daten analysieren, wählen Sie Regions of Interest (ROI), dass der Injektionsstelle zu decken. Als Negativ-Kontrolle, kann eine ähnliche ROI für die nicht-operierten Bein ausgewählt werden. Mit der Software, messen die gesamte Ausstrahlung, die in Einheiten von Photonen / Sekunde / cm 2 / Steradiant (p / s / cm 2 / sr) ausgedrückt wird, für die ROIs für jeden Zeitpunkt. Der maximale Wert sollte in der endgültigen Daten verwendet werden. Die Daten können auch an Excel-Tabelle für die zukünftige Verwendung exportiert werden.
- Sobald alle Daten erfasst, kehren die Tiere zur Erholung Käfig und überwachen kontinuierlich, bis das Tier erwacht.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Zellen im Laufe der Zeit zu verfolgen.
- Bei einem gewünschten Zeitpunkt kann das Tier für die Beurteilung von Gewebe-Funktion eingeschläfert werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Vertreter Biolumineszenz Bild von transplantierten Zellen in der linken Hinterlauf ischämischen ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei der Aufnahme der Biolumineszenz, wird die Intensität, mit der Zeit zunehmen, und der maximale Wert während der Zeit natürlich erhalten sollte als der letzte Wert gemeldet werden.
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Discussion
ESZ sind eine vielversprechende Quelle Zelle für die Behandlung von Gewebe-Ischämie aufgrund ihrer Plastizität der Differenzierung und ihre Fähigkeit, sich zu erheben, um Zelllinien aus aller drei Keimblätter, einschließlich Endothelzellen geben. Zur Überwindung der ethischen Bedenken mit ESC verbunden sind, können induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) eine Alternative pluripotente Stammzelle Quelle, die die ethischen Bedenken überwindet werden. Neben WSR können adulte Stammzellen, wie endotheliale Vorläuferzellen (EPC) und hämatopoetische Stammzellen (HSZ) ebenfalls verwendet werden, aber diese Zelltypen können nur begrenzte therapeutische Wirkung bei Patienten mit PAVK. Intramuskuläre Verabreichung von Zellen ist minimal-invasiv und einfach durchzuführen, und diese Art der Zustellung ist auch offen für die Lieferung von löslichen Faktoren oder Plasmide. Allerdings kann für einen leichteren Zugang der transplantierten Zellen, die Blutgefäße, die systemische Verabreichung in die Oberschenkelarterie oder Schwanzvene statt intramuskuläre Injektionen verwendet werden.
Biolumineszenz-Bildgebung bietet den Vorteil der Durchführung mit hohem Durchsatz und nicht-invasive Verfolgung der das Überleben der Zelle. Wenn mit funktionellen Assays, wie Laser-Doppler-Durchblutung oder histologische Analyse der Neovaskularisation kombiniert, können diese Techniken zusammen Forschern erlauben, die therapeutische Wirkung der Stammzelltransplantation bei der Beitreibung von Hinterlauf Ischämie zu beurteilen.
Zusammenfassend haben wir eine einfache und reproduzierbare Methode für die Bereitstellung und Verfolgung von ESC-derived Endothelzellen für die Behandlung von Hinterlauf Ischämie demonstriert.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, und die Stanford Small Animal Imaging Core für die technische Unterstützung. Die Autoren danken AM Bickford, Inc. für die Unterstützung der tierärztlichen Einrichtungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), der California Tobacco Related Disease Research Program der University of California (15IT-0257 und 1514RT-0169) unterstützt und das California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183).
NH wird durch ein Stipendium der American Heart Association unterstützt. kann Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. JoVE. , (2008).
- Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).
- Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 408, 926-926 (2000).
- De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging. Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Med. 4, 245-247 (1998).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).
- Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113, 1005-1114 (2006).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
