Summary
인도에 대한 수술 배아 줄기 세포 - 파생 허혈성 hindlimb에 내피 세포가 bioluminescence 이미징에 의해 비침습 추적, 증명합니다.
Abstract
다리와 발에 산소를 혈액과 영양소를 공급 주변 동맥이 좁아에서 주변 동맥 질환 (PAD) 결과,이 병리 같은 간헐 claudication (도보로 통증), 고통스러운 허혈성 ulcerations, 심지어 사지 위협 괴저와 같은 증상을 초래합니다. 이것은 일반적으로 혈관 내피 모든 혈액과 림프 혈관의 luminal 표면을 투자 내피 세포 monolayer이 혈관 항상성 및 혈관 재생에 지배적인 역할을 것으로 생각됩니다. 그 결과, 내피의 세포 기반의 재생을 막기위한 것이 PAD 치료를위한 유망한 접근법 수 있습니다.
이 비디오에서는, 우리는 배아 줄기 세포 (ESC)의 이식을 보여주 파생 bioluminescence 이미징에 의해 유도 세포 및 생존의 비침습 추적 다음 PAD의 모델로 일방적 hindimb 국소 빈혈의 치료에 대한 내피 세포를. 세포 전달 및 이미징에 대한 구체적인 자료와 절차가 설명됩니다. 이 프로토콜은 니이야마 외 의해 hindlimb 국소 빈혈의 유도를 설명하는 다른 간행물을 준수 1.
Protocol
1. 내피 세포에 murine ESCs의 분화
- 내피 세포에 ESCs을 차별에 대한 프로토콜은 다른 설명이 프로토콜 2,3의 초점이 아닙니다. 간단히, 세포가 차별 허용, 그리고 CD31 또는 혈관 내피 cadherin (VE - cadherin)로 내피 표시 양성 반응 세포는 다음 형광 활성 세포 분류 (외과)에 의해 정화하고 있습니다.
2. 더블 퓨전 리포터 유전자와 Lentiviral 도입 구축
- Bioluminescence 그러한 반딧불 루시페라제 (fluc)로 기자 유전자의 표현을 수정 세포를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램에 대한 우리의 세포는 내부 ubiquitin 발기인의 통제하에 둘 fluc 및 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 융합 유전자가 포함되어 있습니다. 세포를 수정하기 위해, 주요 최적의 유전 요소를 포함하는 transgene lentiviral 벡터가 수행하는 바이오 안전 기준뿐만 아니라 증가 전달의 효율성, fluc - eGFP 퓨전 리포터 유전자를 가지고 우리가 실험실에서 개발된 pFU - FG 벡터는 안정적으로 사용할 수 있습니다 차별화 후 세포를 transduce. 이 융합 구조는 이식 세포의 bioluminescence과 형광 추적 모두 가능합니다. 바이러스 입자 전달 및 고속 기자의 유전자가 다른 네 설명되는 레이블 세포의 생산을 생성하기위한 절차.
3. 허혈성 hindlimb로의 이식 ESC - 파생 내피 세포
- 세포 이식에 대한 hindlimb 국소 빈혈 공사를 가진 마우스를 준비하여 절차를 시작합니다. 이렇게하려면 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1~3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오.
- 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 그런 다음, 운영 테이블에 위로 향한 위치에 동물을 배치하고 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1~3%의 지속적인 흐름에 연결합니다.
- 세 교대 betadine 및 알코올 스크럽으로 hindlimb의 피부를 닦아주십시오.
- 피부가 청소되면, 인산 30 μL에 백만 ESC - 파생 내피 세포를 얻을 호수 (PBS)가 버퍼. 28 게이지 바늘로 이들 세포를로드합니다.
- 세포가 준비가되면, 부드럽게 리프트와 더 나은 gastrocnemius 근육의 위치를 시각화하기 위해 hindlimb을 확장. 다리가 확장되는 동안, 기본 근육으로 피부를 통해 바늘을 삽입합니다. 뼈 접근하지 몸조심. 부드럽게 천천히 gastrocnemius에 30 μL 세포 혼합물을 주입. 근육내 주사의 경우, 30 μL가 주입 수있는 볼륨의 한계 가까운 거리에 있습니다. 우리의 경험, 그들이 주사기의 바늘에있는 손실 볼륨을 제거 때문에 따라서, 28 게이지 인슐린 주사기가 선호됩니다.
- 주입이 완료되면 복구 케이지 마우스를 반환하고 정신 때까지 지속적으로 그것을 모니터합니다. 동물이 몇 시간 동안 회복 후 이식 세포의 생체내 bioluminescence 이미징에서 진행하도록 허용합니다.
4. 생체내에서 ESC - 파생 내피 세포의 Bioluminescence 이미징
- 이식 ESC - 파생 endothelials 전지는 내부 ubiquitin 발기인의 통제하에 fluc과 eGFP 융합 유전자를 모두 표현하기 위해 수정되었습니다. 따라서, bioluminescence은 허혈성 hindlimb 내에서 세포를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
- 이 단계를 시작하려면, bioluminescence 이미징 시스템 및 생활 이미지 수집 소프트웨어를 켭니다. 다음 수집 시스템을 초기화하고보기의 필드의 크기를 지정합니다.
- 배경 방사를 흡수하기 위해 이미징 상자에 다음 장소 검은색 무광택 용지.
- 이미지 상자가 준비되면, 1L/min의 출력에 산소 isoflurane 1~3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 필요에 따라 전기 면도기를 사용하는 두 hindlimbs에서 머리를 제거합니다.
- 복막에 체중 g 당 D - luciferin 10 μL를 주입. D - luciferin 15 MG / PBS에 ML의 필터링된 재고 솔루션으로 사전에 준비가되어 있습니다.
- luciferin가 주입되면 isoflurane의 지속적인 흐름에 연결된 부정사 위치에 검은 종이,을 통해 영상 상자에 동물을 놓으십시오.
- 이미지 상자에 동물을 배치하고 isoflurane에 연결.
- 이미지가 포화되지 않은 최적의 노출 시간을 결정하기 위해 10~60초에 대한 이미지를 얻기 시작합니다. 이미지가 포화되면, 노출 시간을 줄일 수 있습니다. bioluminescence 신호가 매우 약한 경우, 노출 시간을 향상시킬 수 있습니다.
- 저기서신호가 최대 후 페이드에 도달할 때까지 g 최적의 노출 시간, 사진마다 1~3분을 획득 계속합니다. 인수가 완료되면 파일을 저장합니다.
- 데이터를 분석하려면, 주사 사이트를 커버 관심 지역 (로아)을 선택합니다. 대조군으로 유사한 투자 수익 (ROI)가 아닌 운영 다리를위한 선택하실 수 있습니다. 소프트웨어를 사용하여 각 timepoint에 대한 로아에 대한 광자 / 초 / cm 2 / steradian (P / S / cm 2 / SR)의 단위로 표현되는 총 빛을, 측정합니다. 최대한의 가치는 최종 데이터를 사용해야합니다. 데이터는 나중에 사용하기 위해 Excel 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다.
- 일단 모든 데이터가 취득되어 복구 케이지에 동물을 반환하고 동물 깨우고 때까지 지속적으로 모니터링합니다.
- 시간이 지남에 따라 세포를 추적하기 위해이 절차를 반복합니다.
- 원하는 시점에서, 동물은 조직 기능의 평가 euthanized 수 있습니다.
5. 대표 결과
왼쪽 허혈성 hindlimb에 이식 세포의 대표 bioluminescence 이미지는 그림 1에 표시됩니다. bioluminescence 취득하는 동안, 강도는 시간이 증가되며, 시간 과정 중에 얻은 최대 값이 최종 값으로보고해야합니다.
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Discussion
ESCs 때문에 차별과 내피 세포를 포함한 세 세균 레이어를 구성하는 세포 lineages을 일으키다 능력 그들의 소성의 조직 국소 빈혈의 치료를 위해 유망한 전지 소스입니다. ESCs과 관련된 윤리적 문제를 극복하기 위해 유도 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 윤리 문제를 극복 대안 pluripotent 줄기 세포 원천 수 있습니다. ESCs 게다가, 이러한 내피 전구 세포 (EPCs) 및 조혈 줄기 세포 (HSCs)와 같은 성인 줄기 세포도 사용할 수 있지만, 이러한 세포 유형 PAD 환자에서 제한된 치료 효과가있을 수 있습니다. 세포의 근육내 배달 법으로서하고 수행하기 위해 간단하고, 전달이 모드는 가용성 요소 또는 plasmids의 전달 의무가 있습니다. 그러나, 대퇴 동맥이나 꼬리 정맥에 vasculature, 체계 전달하기 위해 이식 세포가 쉽게 액세스할 수 있도록 근육내 주사 대신 사용할 수 있습니다.
Bioluminescence 이미징은 세포 생존의 높은 처리량 및 비침습 추적을 수행하는 장점을 제공합니다. 이러한 레이저 도플러 혈액 관류 또는 neovascularization의 histological 분석과 같은 기능 assays과 결합하면, 함께이 기술은 연구자가 hindlimb 국소 빈혈의 회복에 대한 세포 이식의 치료 효과를 평가할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 hindlimb 국소 빈혈의 치료에 ESC - 파생 내피 세포의 제공 및 추적을위한 간단하고 재현성 방법을 증명하고있다.
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Acknowledgments
저자 안드레아 액스텔, 사토시 이토, MD, 제프 Velotta, MD, 그랜트 호이트, 로버트 C. 로빈스, MD, 진 유, MD, 팀 도일, 박사, 그리고 기술 지원을위한 스탠포드 작은 동물 이미징 핵심 주셔서 감사합니다. 저자는 또한, 수의 장비의 지원을 오전 비크포드 (주) 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원에서 연구 기금 (R01 HL - 75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), 캘리포니아 대학 (15IT - 0257 및 1514RT - 0169)의 캘리포니아 담배 관련 질병 연구 프로그램에 의해 지원되었다 및 재생 의료 (RS1 - 00183)의 캘리포니아 연구소.
NH는 미국 심장 협회에서 친교에 의해 지원됩니다. 심장 협회 수 있습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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