Summary
के वितरण के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न इस्कीमिक hindlimb endothelial कोशिकाओं, bioluminescence इमेजिंग द्वारा गैर इनवेसिव ट्रैकिंग के साथ प्रदर्शन किया है.
Abstract
परिधीय परिधीय धमनियों का संकुचन है कि पैर और पैरों के लिए oxygenated रक्त और पोषक तत्वों की आपूर्ति से धमनी रोग (पैड) के परिणाम, इस विकृति आंतरायिक खंजता (दर्द चलने के साथ), दर्दनाक इस्कीमिक ulcerations, या भी अंग की धमकी कोथ जैसे लक्षण का कारण बनता है. आमतौर पर यह माना है कि संवहनी endothelium, endothelial कोशिकाओं की एक monolayer है कि सभी रक्त और लसीका वाहिकाओं के luminal सतह निवेश, संवहनी homeostasis और संवहनी उत्थान में एक प्रमुख भूमिका निभाता है है. एक परिणाम के रूप में, स्टेम सेल आधारित endothelium के उत्थान पैड के इलाज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण हो सकता है.
इस वीडियो में, हम भ्रूण स्टेम सेल का प्रत्यारोपण (ईएससी) का प्रदर्शन व्युत्पन्न पैड की एक मॉडल के रूप में एकतरफा hindimb ischemia के इलाज के लिए endothelial कोशिकाओं, bioluminescence इमेजिंग द्वारा घर वापस आना और सेल अस्तित्व के गैर इनवेसिव ट्रैकिंग द्वारा पीछा किया. सेल वितरण और इमेजिंग के लिए विशिष्ट सामग्री और प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाएगा. इस प्रोटोकॉल Niiyama एट अल द्वारा hindlimb ischemia के प्रेरण का वर्णन करने में एक अन्य प्रकाशन के बाद 1 .
Protocol
1. Murine ESCs के endothelial कोशिकाओं में भेदभाव
- endothelial कोशिकाओं में ESCs फर्क के लिए प्रोटोकॉल कहीं वर्णित है और इस 2,3 प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं है. संक्षेप में, कोशिकाओं के अंतर की अनुमति दी हैं, और कोशिकाओं है कि CD31 या संवहनी endothelial cadherin (VE-cadherin) जैसे endothelial मार्करों के लिए सकारात्मक रहे हैं तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के द्वारा शुद्ध कर रहे हैं.
2. डबल फ्यूजन रिपोर्टर जीन और lentiviral transduction का निर्माण
- Bioluminescence कोशिकाओं है कि जुगनू luciferase (fluc) जैसे रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए संशोधित कर रहे हैं पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस आवेदन के लिए, हमारी कोशिकाओं को एक आंतरिक ubiquitin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत दोनों fluc और बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EGFP) संलयन जीन होते हैं. आदेश में कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए, transgene lentiviral कुंजी अनुकूलित आनुवंशिक तत्वों से युक्त वेक्टर को पूरा करने के लिए जैव सुरक्षा मापदंड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बढ़ पारगमन दक्षता, Pfu-FG fluc संलयन EGFP रिपोर्टर जीन ले जाने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित वेक्टर stably के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है भेदभाव के बाद कोशिकाओं transduce. इस संलयन का निर्माण दोनों bioluminescence और प्रतिरोपित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति ट्रैकिंग सक्षम बनाता है. वायरस कणों, पारगमन और लेबल कोशिकाओं है कि व्यक्त रिपोर्टर जीन 4 कहीं और वर्णित है के उत्पादन पैदा करने के लिए प्रक्रिया .
3. व्युत्पन्न के ट्रांसप्लांटेशन ईएससी इस्कीमिक hindlimb endothelial कोशिकाओं
- एक चूहा है कि सेल प्रत्यारोपण के लिए hindlimb ischemia आया है तैयार करके प्रक्रिया शुरू करो. ऐसा करने के लिए, संज्ञाहरण प्रेरण चेंबर में 1-3% 1L/min की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में isoflurane युक्त माउस जगह है.
- प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दो जब तक यह बाह्य stimuli करने के लिए अनुत्तरदायी है. फिर प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें.
- फिर, ऑपरेटिंग मेज पर लापरवाह स्थिति में जानवर और जगह 1L/min की एक प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 1-3% isoflurane की एक सतत प्रवाह से कनेक्ट.
- तीन betadine और शराब scrubs की बारी के साथ hindlimb की त्वचा को साफ कर लें.
- एक बार त्वचा साफ किया जाता है, फॉस्फेट के 30 μL में एक मिलियन ईएससी व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं प्राप्त खारा (पीबीएस) buffered. इन कोशिकाओं को एक 28 गेज सुई में लोड.
- जब कोशिकाओं को तैयार हैं, धीरे से उठा और hindlimb विस्तार करने के लिए बेहतर gastrocnemius मांसपेशियों के स्थान कल्पना. जबकि पैर बढ़ाया है, त्वचा के माध्यम से अंतर्निहित मांसपेशियों में सुई डालने. ख्याल रखना हड्डी दृष्टिकोण नहीं है. धीरे और धीरे धीरे gastrocnemius में 30 μL सेल मिश्रण इंजेक्षन. Intramuscular इंजेक्शन के लिए, 30 μL इंजेक्शन जा सकता है कि मात्रा की सीमा के करीब है. इसलिए, 28 गेज इंसुलिन सीरिंज, क्योंकि हमारे अनुभव में, वे सिरिंज सुई में नुकसान की मात्रा को खत्म करने के लिए पसंद कर रहे हैं.
- इंजेक्शन के बाद पूरा हो गया है, वसूली पिंजरे के लिए माउस लौटने और जाग जब तक निगरानी लगातार. जानवर कई घंटे के लिए ठीक करने के लिए और फिर प्रतिरोपित कोशिकाओं के vivo bioluminescence इमेजिंग में साथ आगे बढ़ना करने की अनुमति दें.
4. Vivo में ESC व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं के bioluminescence इमेजिंग
- प्रतिरोपित ईएससी व्युत्पन्न endothelials कोशिकाओं के लिए दोनों और एक आंतरिक ubiquitin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत EGFP संलयन जीन fluc व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया है. इसलिए, bioluminescence इस्कीमिक hindlimb के भीतर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- इस कदम शुरू करने के लिए, bioluminescence इमेजिंग प्रणाली और लिविंग छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर बारी. फिर अधिग्रहण प्रणाली इनिशियलाइज़ और देखने के क्षेत्र के आयाम निर्दिष्ट.
- अगला इमेजिंग के लिए पृष्ठभूमि के उत्सर्जन को अवशोषित बॉक्स पर जगह काले मैट कागज.
- एक बार इमेजिंग बॉक्स तैयार है, संज्ञाहरण प्रेरण 1L/min के उत्पादन में 1-3% ऑक्सीजन में isoflurane युक्त कक्ष में माउस जगह है. प्रेरण कक्ष में माउस छोड़ दो जब तक यह बाह्य stimuli करने के लिए अनुत्तरदायी है. फिर प्रेरण कक्ष से पशु हटा दें.
- दोनों आवश्यक के रूप में एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग hindlimbs से बाल निकालें.
- शरीर के वजन के प्रति ग्राम peritoneum में डी luciferin के 10 μL इंजेक्षन. डी luciferin अग्रिम में 15 मिलीग्राम / पीबीएस में एमएल के फ़िल्टर शेयर समाधान में तैयार है.
- एक बार luciferin अंतःक्षिप्त है, इमेजिंग बॉक्स में लापरवाह स्थिति में काले कागज, isoflurane की एक सतत प्रवाह से जुड़े से अधिक जानवरों की जगह.
- इमेजिंग बॉक्स में पशु रखने और isoflurane को जोड़ने.
- 10-60 सेकंड के लिए छवियों को प्राप्त क्रम में एक इष्टतम जोखिम समय है जिसके लिए छवि संतृप्त नहीं है का निर्धारण शुरू करो. यदि छवि संतृप्त हो जाता है, समय जोखिम को कम. यदि bioluminescence संकेत बहुत कमजोर है, जोखिम समय में वृद्धि.
- Usinइष्टतम जोखिम समय जी, चित्र हर 1-3 मिनट प्राप्त जारी जब तक संकेत अधिकतम और फिर fades तक पहुँचता है. जब अधिग्रहण पूरा हो गया है, तो फ़ाइल सहेजें.
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए, हित के क्षेत्रों (ROIs) कि इंजेक्शन साइट को कवर का चयन करें. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक समान रॉय गैर संचालित पैर के लिए चयनित किया जा सकता है है. सॉफ्टवेयर का प्रयोग, कुल, प्रत्येक timepoint लिए ROIs के लिए चमक जो फोटॉनों / सेकंड / 2 / steradian (पी / एस / 2 सेमी / sr) सेमी की इकाइयों में व्यक्त किया है, उपाय . अधिक से अधिक मूल्य अंतिम डेटा में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. आंकड़े यह भी भविष्य में उपयोग के लिए एक्सेल स्प्रेडशीट के लिए निर्यात किया जा सकता है.
- एक बार सभी डेटा प्राप्त कर लिया है, वसूली पिंजरे के लिए जानवरों की वापसी और जानवर जागता है जब तक निगरानी लगातार.
- इस कार्यविधि को दोहराएँ समय के साथ कोशिकाओं को ट्रैक.
- एक वांछित समय बिंदु पर, पशु ऊतक समारोह के मूल्यांकन के लिए euthanized किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
बाईं इस्कीमिक hindlimb में प्रतिरोपित कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि bioluminescence छवि चित्र 1 में दिखाया गया है. Bioluminescence के अधिग्रहण के दौरान, तीव्रता समय के साथ वृद्धि हुई है, और समय के दौरान अधिकतम मूल्य प्राप्त अंतिम मूल्य के रूप में सूचित किया जाना चाहिए.
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Discussion
ESCs भेदभाव और उनके सेल सभी तीन रोगाणु परतें, endothelial कोशिकाओं सहित शामिल प्रजातियों को जन्म देने की क्षमता उनके plasticity की वजह से से ऊतक ischemia के इलाज के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत हैं. ESCs के साथ जुड़े नैतिक चिंताओं पर काबू पाने के लिए, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) एक वैकल्पिक pluripotent स्टेम सेल के स्रोत है कि नैतिक सरोकारों पर काबू किया जा सकता है. ESCs अलावा, endothelial पूर्वज (निर्यात संवर्धन परिषदों) कोशिकाओं और hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) के रूप में वयस्क स्टेम कोशिकाओं को भी इस्तेमाल किया जा सकता है हो सकता है, लेकिन इन प्रकार की कोशिकाओं पैड के साथ रोगियों में उपचारात्मक प्रभाव सीमित हो सकता है. कक्षों की इंट्रामस्क्युलर वितरण न्यूनतम इनवेसिव और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और प्रसव के इस मोड भी घुलनशील कारकों या plasmids के वितरण के लिए उत्तरदायी है. हालांकि, vasculature, और्विक धमनी या पूंछ नस में प्रणालीगत प्रसव के लिए प्रतिरोपित कोशिकाओं के आसान उपयोग के लिए intramuscular इंजेक्शन के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
Bioluminescence इमेजिंग सेल अस्तित्व के उच्च throughput और गैर इनवेसिव ट्रैकिंग प्रदर्शन का लाभ प्रदान करता है. जब लेजर डॉपलर रक्त छिड़काव या neovascularization के histological विश्लेषण जैसे कार्यात्मक assays के साथ संयुक्त, इन तकनीकों के साथ शोधकर्ताओं hindlimb ischemia की वसूली पर कोशिका प्रत्यारोपण के उपचारात्मक प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुमति दे सकते हैं.
अंत में, हम पहुंचाने और hindlimb ischemia के उपचार के लिए ESC व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन किया.
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Acknowledgments
लेखक Andrea Axtell, सातोशी Itoh, एमडी, जेफ Velotta, एमडी, अनुदान होयत, रॉबर्ट सी. रॉबिंस, एमडी, जिन यू, एमडी, टिम डोयल, पीएचडी, और स्टैनफोर्ड तकनीकी सहायता के लिए छोटे पशु इमेजिंग कोर धन्यवाद. लेखकों को भी AM Bickford इंक पशु चिकित्सा उपकरणों के समर्थन के लिए धन्यवाद. इस शोध स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुसंधान अनुदान (HL-75,774 R01, R01 CA098303, HL085743 R21, HL087746 1K12), कैलिफोर्निया तंबाकू कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (15IT 0257 और 1514RT-0169) से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया , और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (RS1 ००,१८३).
राष्ट्रीय राजमार्ग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. हार्ट एसोसिएशन कर सकते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. JoVE. , (2008).
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