Overview
Source : Vy M. Dong et Le Diane, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
Synthèse en phase solide de Merrifield est un prix Nobel invention où une molécule du réactif est liée sur un support solide et subit des réactions chimiques successives pour former un composé désiré. Lorsque les molécules sont liées à un support solide, sous-produits et réactifs excédentaires peuvent être retirés en emportant les impuretés, tandis que le composé cible demeure lié à la résine. Plus précisément, nous permettra de présenter un exemple de synthèse de peptide de phase solide (RCR) pour illustrer ce concept.
Principles
Synthèse en phase solide est une méthode utilisée pour simplifier la synthèse de molécules. Il est souvent utilisé en chimie combinatoire (une technique utilisée pour préparer un grand nombre de molécules dans un court laps de temps), pour générer des bibliothèques de composés due à la facilité de la purification et la synthèse chimique dans l’ensemble. Synthèse en phase solide implique généralement l’utilisation d’une résine ; un matériau non soluble, à base de polymères, qui est pre-functionalized donc le départ blockcan bâtiment facilement lier. Les blocs de construction sont généralement protégés lorsqu’ils sont ajoutés sur la résine, et ils peuvent être facilement déprotégés et traités avec le prochain bloc de construction désiré en solution (Figure 1). Une fois qu’on a synthétisé la molécule désirée, elle peut facilement être clivée de la résine.
Parce qu’il est robuste, synthèse en phase solide a été utilisée pour synthétiser des acides nucléiques, oligosaccharides et le plus souvent, des peptides. Découvert et rapporté par Robert Bruce Merrifield en 1963, un RCR est devenue la méthode la plus utilisée pour générer des bibliothèques de peptides. Merrifield a remporté le prix Nobel de 1984 pour l’invention de RCR. Un RCR peut profiter facilement du Fmoc (sensible à la base) ou Boc (acide sensible)N-protéger les groupes sur les acides aminés à accumuler des bibliothèques de peptides dans un court laps de temps. HBTU (agent de couplage) et i-Pr2EtN (base) activent le C-terminus de l’acide aminé pour le couplage avec un autre acide aminé. Fmoc groupes protecteurs peut être enlevée par 4-méthylpipéridine, tandis que Boc groupes protecteurs peut être enlevée par des acides forts comme l’acide trifluoroacétique. Dans cette expérience, nous allons démontrer un RCR grâce à la synthèse d’un dipeptide. Nous allons utiliser le test de Kaiser, une méthode qualitative pour tester la présence d’amines primaires, pour surveiller la progression de la réaction.
La figure 1. Concept qui sous-tend la synthèse de peptide de phase solide (SPPS).
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Procedure
1. chargement de la résine
- Pour un navire de synthèse de peptide 100mL, ajouter résine de chlorure (CCT) 2-chlorotrityl (1,1 mmol/g, g 0,360, 0.400 mmol). Ajouter 20 mL de DMF et laissez-les gonfler pendant 30 min sous le N2.
- Égoutter les perles sous vide et ajouter 10 mL de DMF.
- Ajouter 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) et 2,5 mL i -Pr2EtN et mélanger sous N2 pendant 15 min.
- Égoutter le solvant sous vide et répéter le chargement avec Fmoc-Ala-OH pendant 15 min.
- Égoutter le solvant sous vide et laver les perles 10 ml DMFunder N2et égoutter sous vide 3 x.
2. la déprotection du groupe Fmoc
- Ajouter 10 mL 20 % 4-méthylpipéridine dans le DMF et remuer les perles sous N2 pendant 15 min.
- Égoutter le solvant sous vide et répétez la déprotection.
- Laver les billes avec 10 mL de DMF sous N2 et drain sous vide 3 x.
3. exécution de l’essai de Kaiser
- Effectuer le test de Kaiser en ajoutant 1 à 2 gouttes de solution A (0,5 mL 0,01 M KCN, pyridine 24,5 mL), solution B (1 g ninhydrine, 20 mL de n-butanol) et la solution C (phénol 20 g, 10 mL de n-butanol) chacun dans deux tubes à essai. Un tube à essai sera le contrôle tandis que l’autre va surveiller la réaction.
- Ajouter quelques perles de la résine de la cuve de réaction à éprouvette de réaction et de la chaleur vers le haut les deux tubes à essai à 110 ° C.
- Si la déprotection est terminée, le contenu du tube à essai prennent une couleur bleu/violet foncée. Si la déprotection est incomplète ou défaillante, la solution reste jaune. Comparer l’éprouvette de réaction avec l’éprouvette de contrôle.
4. les blocs de construction prochaine de couplage
- Égoutter le solvant sous vide.
- Laver les billes avec 10 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone N2 et vidange le solvant sous vide.
- Pour commencer le prochain accouplement, ajoutez 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) et 2,5 mLi -Pr2EtN et laissez la résine à bouillonner sous N2 pour 30 min.
- Égoutter le solvant sous vide.
- Laver les billes avec 10 mL de DMF sous N2 et drain sous vide 3 x.
- Effectuer le Kaiser pour chercher l’achèvement de l’assemblage d’essai (voir étapes 3.1 à 3.3). Les perles et la solution dans l’éprouvette doivent être jaunes.
5. clivage du Peptide au large de la résine
- Fendre le reste du groupe Fmoc procédant 2.1 à 2.3.
- Après que le solvant est drainé sous vide, ajouter 40 mL de solution de clivage (95 % TFA, 2,5 % H2O, conseils de 2,5 %) à la résine et la bulle sous N2 pendant 3 h.
- Placer un nouveau ballon récepteur sur le synthétiseur de peptide et vidange theTFA solution contenant le peptide désiré sous vide dans le ballon à nouveau.
6. précipitation et j’ai la consolation du Peptide
- Séparer la solution TFA en 4 fioles coniques et ajouter 25 mL éther diéthylique froid (−20 ° C) à chaque flacon à précipiter le peptide.
- Centrifuger les flacons (3 000 tr/min, 0-4 ° C) pendant 20 min. décanter le reste de la solution TFA et éther des fioles coniques et de concentrer le précipité de peptide pour s’offrir le dipeptide désiré comme un solide blanc.
Synthèse en phase solide est une méthode dans laquelle le produit est synthétisé tout lié à une matière insoluble.
Synthèse en phase solide est souvent utilisée pour produire biologiques oligomères et polymères tels que des peptides, acides nucléiques et oligosaccharides. Ces molécules sont composées de chaînes plus petites des sous-unités moléculaires, appelées monomères. Synthétiser un oligomère ou polymère prend beaucoup d’étapes, les monomères s’ajoutent dans le bon ordre.
Un problème avec des synthèses multi-étapes, c’est cette purification et isolement des produits stables de chaque étape, appelée produits intermédiaires, diminue le rendement global. Dans la synthèse en phase solide, le produit intermédiaire demeure lié au solid soutien tout au long de la synthèse. Cela permet des réactifs de phase soluble, des solvants et des sous-produits à être emportés, éliminant le besoin de purifier et d’isoler chaque produit intermédiaire entre les étapes.
Cette vidéo va illustrer la procédure pour la synthèse de peptide de phase solide et introduire quelques applications de synthèse en phase solide en chimie.
Dans la synthèse en phase solide, une molécule est synthétisée sur un support solide dans une séquence de réactions. Par exemple, un oligomère ou polymère sera synthétisé un monomère à la fois pour former le produit final. Le croissant oligomère ou polymère reste fortement lié à l’appui solide jusqu'à ce qu’elle est séparée, ou clivés, du soutien avec des réactifs.
Chaque monomère doit avoir au moins deux sites de fixation de faire partie de la chaîne polymère, mais seulement un accepteur peut être disponible à la fois pour s’assurer que le monomère se lie à l’atome correct. Ceci est réalisé avec les groupes protecteurs, qui sont des groupes fonctionnels qui ne sont pas réactifs pendant une ou plusieurs étapes de la synthèse. Le site de liaison est restauré ou déprotégé, en traitant de la molécule avec des réactifs spécifiques pour convertir la protection du groupe à un groupe fonctionnel réactif.
Pour commencer la synthèse en phase solide, le matériel de départ est lié à une résine spécialement conçue ou polymère insoluble sur son site de liaison disponible uniquement. Ensuite, le produit de départ lié est déprotégé pour autoriser la liaison du second monomère dans la chaîne. Ensuite, on ajoute une solution de monomère deuxième dans la chaîne, ainsi qu’un agent de couplage pour faciliter la liaison entre les monomères.
Une fois le second monomère se lie à la matière première, produit intermédiaire dimère qui en résulte est déprotégé. Ce processus est répété jusqu'à ce que l’oligomère de cible ou polymère a formé. Le produit est clivé de l’appui solide dans la solution, d'où elle peut être purifiée, isolé et analysé.
Synthèse en phase solide est souvent utilisée pour la synthèse des peptides, qui sont des chaînes d’acides aminés. Les acides aminés ont un groupement amine, un groupe carboxyle et un substituant ou « side chain ». L’amine est protégé au départ. Une fois que déprotégé, l’amine forme une liaison peptidique avec la fonction carboxyle de l’acide aminé suivant.
Maintenant que vous comprenez les principes de la synthèse en phase solide, nous allons passer par une procédure pour la synthèse de peptide de phase solide, dans lequel nous allons démontrer l’addition des deux premiers acides aminés.
Pour commencer la procédure, raccorder un ballon récepteur pour les déchets à un navire de synthèse peptidique manuelle 100 mL. Placez ensuite 0,360 g de résine de chlorure de 2-chlorotrityl dans le navire.
Ajouter 20 mL de diméthylformamide à la résine et laisser les perles de résine gonfler pendant 30 min sous un flux d’azote gazeux. Ensuite, appliquez vide pour drainer le solvant.
Ajouter 10 mL de DMF, 1,6 mmol d’un acide aminé Fmoc-protégé et 2,5 mL de N, N -diisopropyléthylamine au navire. Des bulles sous l’azote gazeux, qui mêle la solution, pendant 15 min charger l’aminoacide protégée sur la résine.
Enlever le solvant sous vide et effectuer un deuxième chargement. Après avoir enlevé le solvant, agiter les perles de résine chargé trois fois en portions de 10 mL de DMF, drainant chaque lavage dans le ballon récepteur.
Ensuite, ajoutez aux talons chargés 10 mL d’une solution à 20 % des 4-méthylpipéridine dans le DMF. Le mélange pendant 15 min à supprimer le groupe Fmoc des bulles.
Égoutter le solvant et répéter la procédure de déprotection. Laver et égoutter la résine chargée trois fois, comme avant. Stocker les perles sous solvant jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’étape suivante.
Pour vérifier que le composé chargé a été complètement déprotégé, placez d’abord 1 à 2 gouttes de chaque solution de test de Kaiser dans deux tubes à essai.
Placer quelques billes chargées dans un tube à essai et chauffer les deux tubes à 110 degrés dans un bain d’huile. La déprotection est terminée si le mélange de la résine s’assombrit bleu au violet, indiquant la présence de groupes amines dans le mélange.
Pour commencer l’étape de l’accouplement, tout d’abord laver les billes avec 10 mL de NMP sous un débit de gaz N2.
Puis, ajouter 10 mL de NMP, 1,6 mmol de l’aminoacide prochaine Fmoc-protégé, 1,6 mmol de l’agent de couplage HBTU et 2,5 mL de DIPEA à la résine chargée.
Bulle de gaz N2 dans le mélange de résine pendant 30 minutes et puis égoutter le solvant. Laver et égoutter les perles avec des portions de 10 mL de DMF trois fois, comme avant.
Refaites le test de Kaiser. Couplage s’est produite avec succès si les perles et la solution virent au jaunes, indiquant qu’aucun groupes amines ne sont présents.
Ensuite, attacher le nouveau groupe Fmoc avec 20 % 4-méthylpipéridine dans le DMF et laver les perles avec des portions de 10 mL de DMF. Répétez le couplage et la déprotection pour chaque autres acides aminés du peptide de la cible.
Après le dernier acide aminé a été déprotégé et les perles de résine ont été lavés, ajouter 40 mL de solution de clivage du peptide de séparer le produit du peptide de la résine.
Bulle de gaz d’azote dans le mélange de résine pour 3 h et ensuite remplacer le ballon récepteur. Transférer la solution du mélange de la résine dans le nouveau ballon récepteur sous vide.
Pour générer le produit final, enlever le solvant avec un évaporateur rotatif.
Synthèse en phase solide est largement utilisée en biologie et en chimie. Regardons quelques exemples.
Synthèse en phase solide ouvre de nombreuses nouvelles voies synthétiques d’oligosaccharides, qui sont de courtes chaînes de monomères de sucres simples avec des rôles biologiques importants, tels que le stockage de l’énergie. Contrairement aux liaisons peptidiques, chaque liaison entre sucres contient un centre stéréogène. Pour synthétiser un oligosaccharide, doivent non seulement les monomères être dans le bon ordre, mais les obligations doivent aussi avoir la stéréochimie correcte. Techniques de synthèse en phase solide ont été développés pour atteler chaque monomère par un processus hautement stéréosélective, qui est aujourd'hui suffisamment raffiné à automatiser.
Synthèse en phase solide est une approche commune à la chimie combinatoire, qui est la pratique de synthétiser de nombreuses variantes d’un composé dans un seul processus synthétique. La résine chargée peut facilement être divisée en portions de réagir avec différents monomères ou molécules. Après chaque réaction, les portions sont lavées et recombinées. Cela est répété jusqu'à ce que le nombre désiré de produits a été généré. Cette technique est particulièrement utile dans la recherche pharmaceutique, car il peut être utilisé pour générer de nouveaux composés ou pour évaluer la réactivité d’un composé avec un large éventail de molécules.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE de synthèse en phase solide. Vous devez maintenant comprendre les principes sous-jacents de synthèse en phase solide, la procédure pour la synthèse de peptide de phase solide et quelques exemples de comment solid phase de synthèse est utilisée en chimie organique. Merci de regarder !
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Results
Résultats représentatifs pour synthesisfor de peptide de phase solide procédure 3.
| Étape de la procédure | Couleur d’une solution |
| 3.1 | Control - clair, jaune clair Réaction de clair, jaune clair |
| 3.2 | Control - clair, jaune clair Réaction-bleu foncé |
| 3.3 | Sombre solution bleue, perles bleus – déprotection complète ou couplage a échoué Incolores, perles jaunes – déprotection a échoué ou l’achèvement complet Solution incolore, perles rouge – incomplète déprotection de couplage ou incomplète |
Tableau 1. Représentant de résultats pour Procédure 3.
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Applications and Summary
Dans cette expérience, nous avons montré un exemple de synthèse en phase solide par l’intermédiaire de RCR grâce à la synthèse d’un dipeptide.
Synthèse en phase solide est largement utilisée en chimie combinatoire pour construire des bibliothèques de composés pour le dépistage rapide. Il a été couramment utilisé pour synthétiser des peptides, oligosaccharides et acides nucléiques. En outre, ce concept a été implémenté dans la synthèse chimique. Parce qu’il est hétérogène, ces réactifs solides-prise en charge peuvent souvent être recyclés et réutilisés dans des réactions subséquentes.
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