Summary
Det kirurgiska ingreppet för leverans av embryonala stamceller som härrör från endotelceller till ischemisk bakdelen visas, med icke-invasiv spårning av bioluminescens avbildning.
Abstract
Perifer arteriell sjukdom (PAD) resultat från förträngning av perifera artärer som försörjer syresatt blod och näringsämnen till benen och fötterna, orsakar denna patologi symtom som claudicatio intermittens (smärta med gå), smärtsamma ischemiska sår, eller till och med lem-hotande kallbrand. Det anses allmänt att det vaskulära endotelet, ett monolager av endotelceller som investerar luminala ytan av alla blod-och lymfkärl, spelar en dominerande roll i vaskulär homeostas och vaskulär förnyelse. Som ett resultat av stamceller-baserade förnyelse av endotelet kan vara en lovande metod för behandling av PAD.
I den här videon visar vi transplantation av embryonala stamceller (ESC) som härrör från endotelceller för behandling av ensidiga hindimb ischemi som en modell för PAD, följt av icke-invasiv spårning av cell målsökande och överlevnad av bioluminescens avbildning. De specifika material och metoder för cell-delivery and imaging kommer att beskrivas. Detta protokoll följer en annan publikation i att beskriva induktion i bakdelen ischemi av Niiyama et al. 1
Protocol
1. Differentiering av murina ekonomiska och sociala råd i endotelceller
- Protokollet för differentiering ekonomiska och sociala råd i endotelceller beskrivs på annat håll och är inte i fokus för detta protokoll 2,3. I korthet är de celler tillåts att differentiera och de celler som är positiva för endothelial markörer som CD31-eller vaskulära endotelceller cadherin (VE-cadherin) sedan renas genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS).
2. Byggandet av Double Fusion Reporter Gene och Lentiviral Transduction
- Bioluminescence kan användas för att spåra celler som modifierats för att uttrycka reporter gener som eldfluga luciferas (fluktuationer). För denna tillämpning våra celler innehåller både fluktuationer och ökad grön fluorescens protein (EGFP) Fusion genen under kontroll av en intern ubiquitin promotor. För att ändra celler, till transgenen Lentiviral vektor som innehåller nyckeln optimerad genetiska element uppfyller biosäkerhet kriterier samt ökad transduktion effektivitet kan PFU-FG vektor utvecklats i vårt labb bär fluktuera EGFP genen fusion reporter användas för att stabilt transduce cellerna efter differentiering. Denna fusion konstruera möjliggör både mareld och fluorescens spårning av de transplanterade cellerna. Förfarandet för att generera viruspartiklar, transduktion och produktion av märkta celler som uttrycker reportern gener beskrivs på annat håll 4.
3. Transplantation av ESC-härledda endotelceller till ischemisk bakbenen
- Inleda förfarandet genom att förbereda en mus som har genomgått bakdelen ischemi för celltransplantation. För att göra detta, placera musen i anestesi induktion kammare som innehåller 1-3% isofluran i 100% syrgas med en flödeshastighet av 1L/min.
- Låt musen i induktionskammare tills det inte svarar på yttre stimuli. Ta sedan bort djuret från induktion kammaren.
- Sedan placera djuret i ryggläge på operationsbordet och koppla den till ett kontinuerligt flöde av 1-3% isofluran i 100% syrgas med en flödeshastighet av 1L/min.
- Torka av huden på bakbenen med tre omväxlande Betadine och alkohol scrubs.
- När huden är rengjord, få miljoner ESC-derived endotelceller i 30 mikroliter av fosfat saltlösning (PBS). Ladda dessa celler i ett 28 gauge nål.
- När cellerna är klara, lyft försiktigt och utöka bakbenen för att bättre visualisera placeringen av gastrocnemiusmuskeln. Medan benet förlängs, stick in nålen genom huden in den underliggande muskeln. Se till att inte närma sig benet. Försiktigt och långsamt injicera 30 mikroliter cellen blandningen i gastrocnemius. För intramuskulär injektion, är 30 mikroliter nära gränsen för volym som kan injiceras. Därför är 28-gauge insulinsprutor föredra eftersom det i vår erfarenhet, de eliminerar förlusten volymen i kanyler.
- Efter injektionen är klar, gå tillbaka musen till återhämtning buren och övervaka det kontinuerligt tills vaken. Låt djuret att återhämta sig i flera timmar och fortsätt sedan med in vivo mareld avbildning av de transplanterade cellerna.
4. Bioluminescence avbildning av ESC-derived endotelceller in vivo
- Den transplanterade ESC-derived endothelials celler ändrades för att uttrycka både fluktuationer och EGFP fusion genen under kontroll av en intern ubiquitin promotor. Därför kan bioluminescens användas för att spåra celler i ischemisk bakbenen.
- Till att börja det här steget, slå på mareld bildsystem och levande bild förvärv programvara. Därefter initierar förvärvet systemet och ange storleken på synfältet.
- Placera svart matt papper på avbildning rutan för att absorbera bakgrunden utsläpp.
- När imaging rutan är klar, placera musen i anestesi induktion kammare som innehåller 1-3% isofluran i syre vid utgången 1L/min. Låt musen i induktionskammare tills det inte svarar på yttre stimuli. Ta sedan bort djuret från induktion kammaren.
- Ta bort hår på båda bakben med en elektrisk rakapparat som behövs.
- Injicera 10 mikroliter av D-luciferin per gram kroppsvikt i bukhinnan. D-luciferin är informerad i filtreras stamlösningar på 15 mg / ml i PBS.
- När luciferin injiceras, placera djuret i bildbehandling rutan över den svarta papper i ryggläge, kopplad till ett kontinuerligt flöde av isofluran.
- Placering djur i bildbehandling boxen och ansluta till isofluran.
- Börja med att skaffa bilder för 10-60 sekunder för att fastställa en optimal exponering tid som bilden inte är mättad. Om bilden blir mättad, minska exponeringstiden. Om bioluminescens signalen är mycket svag, öka exponeringstiden.
- Using den optimala exponeringstid, fortsätter att förvärva bilder varje 1-3 minuter tills signalen når den högsta och sedan bleknar. När förvärvet är klart spara filen.
- Att analysera data väljer regioner av intresse (ROI) som täcker injektionsstället. Som en negativ kontroll, kan en liknande ROI väljas för den icke-opererade benet. Med hjälp av programvaran, mäta den totala utstrålning, som uttrycks i enheter av fotoner / sekunder / cm 2 / steradian (P / S / cm 2 / SR), för ROI för varje tidpunkterna. Det maximala värdet bör användas i de slutliga uppgifterna. Uppgifterna kan också exporteras till Excel-ark för framtida bruk.
- När alla data är förvärvad, tillbaka djuret till återhämtning buren och övervaka kontinuerligt tills djuret vaknar.
- Upprepa denna procedur för att spåra celler över tiden.
- Vid önskad tidpunkt, kan djuret avlivas för bedömning av vävnad funktion.
5. Representativa resultat
En representant bioluminescence bild av transplanterade cellerna i vänstra ischemisk bakdelen visas i figur 1. Under förvärv av mareld, kommer intensiteten öka med tiden, och det högsta värde som erhållits under den tid kursen bör rapporteras som det slutliga värdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekonomiska och sociala råd är en lovande cell källa för behandling av vävnaden ischemi på grund av deras plasticitet av differentiering och deras förmåga att ge upphov till cell linjer som omfattar alla tre groddblad, inklusive endotelceller. För att lösa de etiska problem förknippade med ekonomiska och sociala råd, kan inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) vara ett alternativ pluripotenta stamceller källa som överbryggar de etiska problem. Förutom ekonomiska och sociala råd, kan vuxna stamceller som endotelceller progenitorceller (EPC) och hematopoetiska stamceller (HSCs) kan också användas, men dessa celltyper kan ha begränsad terapeutisk effekt hos patienter med PAD. Intramuskulär leverans av celler är minimalt invasiva och lätt att utföra, och detta leveranssätt är också mottaglig för leverans av lösliga faktorer eller plasmider. Däremot kan för enklare åtkomst av de transplanterade cellerna till kärlsystemet, systemisk leverans i femoralis eller svansvenen användas i stället för intramuskulära injektioner.
Bioluminescens avbildning erbjuder fördelen av att utföra hög genomströmning och icke-invasiv spårning av cellens överlevnad. I kombination med funktionella analysmetoder såsom laser Doppler blod perfusion eller histologiska analysen av kärlnybildning, kan dessa tekniker tillsammans möjliggör för forskare att bedöma den terapeutiska effekten av celltransplantation om återkrav i bakdelen ischemi.
Sammanfattningsvis har vi visat en enkel och reproducerbar metod för att leverera och spårning av ESC-derived endotelceller för behandling i bakdelen ischemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, VD, Tim Doyle, PhD, och Stanford Small Animal Imaging Core för tekniskt stöd. Författarna tackar också AM Bickford, Inc. för att stödja veterinär utrustning. Denna forskning stöddes av forskningsanslag från National Institutes of Health (R01 HL-75.774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California tobaksrelaterade sjukdomar Research Program vid University of California (15IT-0257 och 1514RT-0169) och California Institute för regenerativ medicin (RS1-00.183).
NH stöds av ett stipendium från American Heart Association. kan Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. JoVE. , (2008).
- Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).
- Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 408, 926-926 (2000).
- De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging. Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Med. 4, 245-247 (1998).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).
- Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113, 1005-1114 (2006).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
