Summary
De chirurgische procedure voor het induceren van eenzijdige achterbeen ischemie is aangetoond, met bevestiging van ischemie door een laser Doppler perfusie beeldvorming.
Abstract
In de Verenigde Staten, perifeer arterieel vaatlijden (PAD) treft ongeveer 10 miljoen mensen, en is ook wereldwijd voorkomt. Medische therapieën voor de symptomatische verlichting zijn beperkt. Chirurgische of endovasculaire ingrepen nuttig zijn voor sommige individuen, maar op lange termijn resultaten zijn vaak teleurstellend. Als gevolg hiervan is er behoefte voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën om PAD te behandelen. De muizen achterbeen ischemie voorbereiding is een model van de PAD, en is nuttig voor het testen van nieuwe therapieën. In vergelijking met andere modellen van weefsel ischemie, zoals coronaire of cerebrale slagader afbinden, liesslagader ligatie voorziet in een eenvoudiger model van ischemische weefsel. Andere voordelen van dit model zijn het gemak van de toegang tot de femorale slagader en een lage sterfte.
In deze video, tonen we de methodologie voor de muizenmodel van eenzijdige hindimb ischemie. De specifieke materialen en procedures voor het maken en evalueren van het model zal worden beschreven, inclusief de beoordeling van de ledemaat perfusie door een laser Doppler imaging. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de transplantatie en niet-invasieve volgen van cellen, die wordt aangetoond door Huang et al.. 1.
Protocol
1. Inductie van eenzijdige achterbeen ischemie
- De chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze operatie zijn onder andere: fijne puntige tang, puntig pincet, lente schaar, chirurgische schaar, naald houder en oprolmechanisme. We maken onze eigen oprolmechanisme met behulp van een paperclip, omdat het kleiner is dan in de handel verkrijgbaar oprolmechanisme. Steriliseer deze instrumenten voorafgaand aan de operatie door een autoclaaf of een hot-kraal sterilisator. Een cauterisatie gereedschap en steriele fijne wees wattenstaafjes zal ook nodig zijn voor deze operatie. Het wordt aanbevolen dat de tools opnieuw gesteriliseerd worden aan de tips die nodig zijn tijdens de procedure.
- Wanneer het gereedschap klaar zijn, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min.
- Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer. Het wordt aanbevolen om de narcose voorafgaande spoelen van het vak aan de deksel opening, om de blootstelling aan isofluraan verlagen.
- Plaats dan het dier in rugligging op de pre-operationele tafel en sluit deze aan op een continue stroom van isofluraan. Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, verwijdert u het haar van het achterbeen. Van toepassing ontharingscrème grondig te verwijderen haren.
- Plaats de muis in rugligging op een gedrapeerde verwarmd pad op de operatietafel, en sluit deze aan een continue stroom van isofluraan. Uit te breiden en zet het achterbeen met een stukje tape. Zodra het achterbeen is veilig, veegt u de huid met betadine drie afwisselende en alcohol scrubs. Voor de rest van de chirurgische procedure, gebruik maken van een dissectie microscoop bij 10X of 20X vergroting om een vergrote weergave van het achterbeen regio te krijgen.
- Met behulp van fijne tangen en chirurgische schaar, maken een incisie van de huid, ongeveer 1 cm lang, vanaf de knie naar de mediale dij.
- Met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-bevochtigd fijne puntige wattenstaafjes, zacht borsteltje weg onderhuids vetweefsel rondom de dijspier.
- Breng vervolgens de cauterisatie dwars op incise en ontleden via het onderhuidse vetweefsel van de onderliggende femorale slagader te onthullen.
- Gebruik een oprolmechanisme om de wond te openen en om een beter beeld van de onderste extremiteit vaatstelsel te verkrijgen.
- Met behulp van fijn pincet en een fijne puntige wattenstaafje voorzichtig doorprikken van de vliezige femorale schede om de neurovasculaire bundel bloot te leggen.
- Dan, met een schone set van fijne pincet en een wattenstaafje, ontleden en scheiden de femorale slagader van de lies en de zenuw aan het proximale locatie in de buurt van de lies. Na de ontleding, langs een streng van 7-0 zijden hechtdraad onder het proximale uiteinde van de arteria femoralis. Af te sluiten van de proximale femorale slagader met dubbele knopen. Leg de das op het schip als proximale in de wond zo mogelijk om de lengte te verlaten voor de tweede gelijkspel en een tussenliggende segment dat zal worden doorsneden.
- Scheid de femorale slagader van de lies op de distale ligging dicht bij de knie. Passeren een streng van 7-0 hechtdraad onder het distale uiteinde van de arteria femoralis proximaal van de a. poplitea. Af te sluiten van het schip met dubbele knopen.
- Af te sluiten het distale femorale slagader met een tweede set van dubbele knopen net proximaal van de eerste set van knopen. Deze tweede set van de hechtingen zal worden gebruikt voor het grijpen van de slagader tijdens de transactie procedure.
- Ook voor het grijpen doeleinden, af te sluiten van de proximale femorale slagader met een tweede set van dubbele knopen net distaal van de eerste set van knopen.
- Transect het segment van de arteria femoralis tussen de distale en proximale knopen met een fijne puntige wattenstaafje en een paar van de lente schaar. Wees voorzichtig niet te doorboren de lies muur.
- Verwijder het oprolmechanisme en sluit de incisie met 5-0 Vicryl hechtingen. Deze hechtingen hoeven niet verwijderd te worden op een later tijdstip, omdat ze oplossen op hun eigen.
- Zodra de incisie wordt gesloten, plaats het dier op de top van een gedrapeerd verwarmd pad in het herstel kooi en monitor doorlopend tot wakker.
- Na het dier heeft teruggewonnen voor een uur, ga dan verder met de laser Doppler bloed perfusie stap om de ischemie inductie te bevestigen.
2. Laser Doppler Blood Perfusie
- Om te beginnen de laser Doppler perfusie stap, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min.
- Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer. Het wordt aanbevolen om de narcose voorafgaande spoelen van het vak aan de deksel opening, om de blootstelling aan isofluraan verlagen.
- Leg het dier op de pre-operatietafel verbonden aan continue stroom van isofluraan. Verwijder vervolgens de haren uit het achterbeen met behulp van een elektrisch scheerapparaat, gevolgd door ontharingscrème als nodig is.
- Na het verwijderen van het haar,Plaats het dier op een 37 ° C verwarmd oppervlak gedurende 5 minuten onder continue stroom van isofluraan. Monitor de kerntemperatuur te euthermia te garanderen, de temperatuur veranderingen zullen sterk van invloed zijn perfusie.
- Na 5 minuten, plaats het dier in rugligging op een niet-reflecterende licht-absorberende oppervlak, zoals groen-gekleurde doek, aangesloten op een continue stroom van isofluraan. Uitbreiding van de achterpoten.
- Draai vervolgens op de laser Doppler imager en de aanschaf software en initialiseren van de software. Geef de grootte van het gezichtsveld en resolutie. Het is het beste te houden op het gebied van uitzicht en pixeldichtheid consistent tussen de dieren om te maken toekomstige analyse gemakkelijker te maken.
- Open een nieuw bestand. Druk op start om te beginnen met het verwerven van de beeldgegevens. Het algemeen, de imager detecteert automatisch de afstand van de muis, maar als daarom wordt gevraagd, geeft u de afstand van het dier naar de imager. De laser zal de grenzen van het gezichtsveld en start vervolgens het verwerven van data.
- Na de acquisitie is afgerond, zal het beeld gaan om een reeks kleuren die indicatief zijn voor het niveau van de bloeddoorstroming naar de benen te tonen. De kleuren kan worden ingesteld op een specifieke perfusie bereik om beter te vergelijken van gegevens tussen de dieren.
- Wanneer de data-acquisitie is voltooid, sla het bestand op.
- Ga dan terug het dier om het herstel kooi en permanent toezicht op het dier tot ontwaken.
- Voor het analyseren van de data, gebruikt u de drempel aanpassing in de analyse software om eventuele ruis af te trekken. Een drempel van 0,2 is meestal een redelijke waarde. Selecteer 2 regio's van belang, of ROI, dat elk achterbeen te bedekken. Een verscheidenheid aan bezienswaardigheden kan gebruikt worden om de ROI tussen de ledematen en dieren te standaardiseren. Bepaal dan het gemiddeld perfusie en variabiliteit in de ROI. De perfusie verschil en perfusie verhouding tussen de ischemische ledematen en controle ledematen kan dan gemakkelijk worden bepaald.
- Deze procedure kan worden herhaald op veranderingen in de doorbloeding achterbeen te volgen in de tijd. Op een gewenst tijdstip, kan het dier worden gedood voor de beoordeling van weefsel functie en vergelijking met perfusie beeldgegevens.
3. Representatieve resultaten:
De anatomie van het achterbeen vasculatuur is weergegeven in figuur 1 2. Een vertegenwoordiger schema van de achterbeen na liesslagader explantatie is weergegeven in figuur 2. Ter bevestiging van de inductie van ischemie van de achterbeen, laser Doppler perfusie beeld analyse toont een dramatische vermindering van de bloedtoevoer naar het ischemische ledematen, in vergelijking met de controle ledemaat, zoals weergegeven in figuur 3.
Figuur 1. Anatomie van het achterbeen vasculatuur. Sterretjes geven de locaties van ligatie voor de inductie van ischemie achterbeen.
Figuur 2. Vertegenwoordiger afbeelding van de anatomie van het achterbeen na ligatie van de arteria femoralis in de proximale en distale plaatsen na het verwijderen van de arteria femoralis.
Figuur 3. Laser Doppler beelden die de bloedstroom voor en na de inductie van ischemie naar links achterbeen (aangegeven met pijl).
Discussion
Er zijn een aantal bronnen van variabiliteit te overwegen, terwijl de planning en uitvoering van achterbeen ischemie modellen. Ten eerste kan het niveau van de ischemie variëren afhankelijk van de locatie van de ligatie met betrekking tot die van de zijtakken. Daarom is voor de consistentie van het model, moeten de dieren ondergaan hetzelfde niveau van arteriële ligatie. Een andere bron van variabiliteit in ischemische herstel is gerelateerd aan de leeftijd van de dieren, met de jonge dieren (6-8 weken oud) met een snellere en meer volledige recovery rates dan oudere dieren (8-10 maanden oud), zoals bepaald door hemodynamische (dat wil zeggen Laser Doppler perfusie) of functionele (dwz loopband testen) maatregelen. Voor studies waarin men de beoordeling van een angiogeen agent, kan het de voorkeur om oudere dieren te gebruiken, omdat een groter verschil tussen de groepen kan worden waargenomen met een therapeutische interventie. Omgekeerd, voor studies waarin men de beoordeling van een anti-angiogene factor, kan het de voorkeur aan jongere dieren te gebruiken om effect size 3 te maximaliseren.
Indien correct uitgevoerd, moet er een minimale complicaties zoals bloeden, infectie, of mortaliteit. Als bloeden gebeurt door toevallige verstoring van de lies of andere schepen, matige druk met een steriele katoenen tip applicator of gaas moet worden toegepast op de site van bloeding tot het bloeden stopt. Dieren die tekenen van infectie moeten worden behandeld met anti-infectieuze middelen. Dieren vertonen significant gangreen kan nodig zijn om beeuthanized. Deze complicatie komt vaker voor bij oudere dieren, en in sommige stammen, zoals BALB c-muizen 4. Daarnaast kan het achterbeen ischemie model lichte tot matige pijn. Daarom moet analgetica zoals buprenorfine of carprofen worden toegediend als nodig is voor de behandeling van pijn, volgens de aanbevelingen van de IACUC.
Tot slot hebben we aangetoond een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bestuderen van PAD in een muizenmodel van achterbeen ischemie. Het achterbeen ischemie model met laser Doppler-analyse is een uitstekend systeem voor het bestuderen van vasculaire pathologie en voor de beoordeling van de therapeutische kandidaten.
Acknowledgments
De auteurs danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, en aan de Stanford Small Animal Imaging Core voor technische ondersteuning. De auteurs danken ook AM Bickford, Inc voor ondersteuning van veterinaire apparatuur. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), de Californische tabak Related Disease Research Program van de University of California (15DAT-0257 en 1514RT-0169) , en het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RS1-00183). NH wordt ondersteund door een beurs van de American Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
