Изготовление Амперометрический Электроды

Summary

Этот протокол описывает, как создавать электроды углеродного волокна. Электроды в дальнейшем использоваться для обнаружения катехоламинов освобождение от пузырьков с углекислым amperometry волокна.

Abstract

Электроды из углеродного волокна имеют решающее значение для выявления выпуска катехоламинов из везикул в одиночных камерах для amperometry измерений. Здесь мы описываем методы, необходимые для создания низкий уровень шума (<0,5 мкА) электроды. Методы были изменены из опубликованных описаний предыдущими исследователями (1,2). Электроды изготавливаются путем подготовки углеродных волокон и резьбы по отдельности в каждом капилляре с помощью вакуума с фильтром для аспирации волокна. Далее, капиллярная трубка с волокна, запряженных электрода съемник, создавая две половины, каждая из которых тонкой заостренной верхушкой. Электроды, смоченным в горячей, жидкой эпоксидной смешивается с отвердителем для создания стеклотекстолита печатью. Наконец, электроды помещаются в печь, чтобы вылечить эпоксидной смолы. Тщательная обработка электродов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы они сделаны последовательно и без повреждений. Этот протокол показывает, как изготовить и сократить амперометрического электроды для записи от отдельных клеток.

Protocol

Часть 1: Подготовка Carbon Fiber

1. Вырезать пучка углеродных волокон (мы используем 7 мкм в диаметре) в длину, которая составляет ~ 1,25 х длина капиллярной пипетки.
2. Удалить размеров путем кипячения ~ 100 мл ацетона в контейнер и добавление волокна к горячему, кипящего ацетона в течение 30 минут или дольше.
3. Удалить волокон из теплого ацетона, и трансфер в стакан с чистой 50-100 мл свежего ацетона.
4. Сухие волокна путем размещения расслоение на открытом 150 мм блюдо Петри и airdry ночь.

Часть 2: Огонь-полировка стеклянные капилляры

1. Пожар-польский каждого капилляра (мы используем микро-гематокрита капиллярных трубок, наружный диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,3 мм, 7,5 см в длину), держа трубку в центр с пинцетом и выставляя конец flame.Rotate трубку о 3 раза в то время как в пламени.
2. Обратить трубки и место противоположный конец к пламени, снова вращающиеся в 3 раза.
3. Место огневой полировкой труб в стеклянную посуду и трансфер в духовке, пока они не готовы быть заполнены углеродных волокон.

Часть 3: Threading углеродного волокна в капиллярной трубке

1. Как и описаний Мачадо и соавт. (2008) и Mundroff и Вайтмана (2002), сосать волокна в стеклянную трубку с использованием пластиковых трубки подключены к вакуум с фильтром.
2. Вырезать волокну с использованием scalpel.Leave ¼ дюйма волокон из трубки.

Часть 4: Тяговая Внесите-волокна в Электрод Puller

1. Место капиллярной трубке в электрод съемник (мы используем Narishige Японии модель ПП-830) и затяните ручки провести капиллярная трубка на месте.
2. Манипулирование переключателями выполнить два тянет, заход в оптимальные настройки съемника.
3. После пипеткой вытягивается в два раза, отдельно две половины резки голого волокна в центре с помощью ножниц.
4. Удалить каждый электрод пополам и потяните выступающие волокна разбить стекло seal.Trim волокна с ножницами так, что только 1 / 8 дюйма волокон остается за пределами трубы.
5. Повторите шаги 1-4, пока около 16 волоконно-электроды вытащил.

Часть 5: Создание стеклотекстолита печать

1. Тепло готовых аликвоту эпоксидной на горячей плите установлен в 55 ° С в течение 6 минут в вытяжном шкафу.
2. Хотя смола отопления, оберните ~ 16 из вытащил электродов в пучок с помощью ленты.
3. После Смола Epon нагревается в течение 6 минут, добавить 0,7 г XOF MPDA к горячей смолой Epon (14%, в / о). Mix, вращая флакон.
4. Dip пучок электродов в горячей эпоксидной плюс отвердитель solution.After около 20 сек, достаточным количеством эпоксидной войдет стекла советы по капиллярного действия.
5. Отменить расслоение, электроды место на картон с прорезями и место этот лоток в духовку до 100 ° F.
6. После по меньшей мере 48 часов, рассмотрим каждый электрод под рассекает microscope.Discard электроды, которые не заполняются эпоксидной смолы, имеют разбил отзыв, иметь более одного волокна, etc.After проверки каждого электрода, место их на картон держателя и обратно в oven.Electrodes, как правило, хорошие в течение 1 месяца после изготовления.

Часть 6: Раскрой Carbon Fiber

1. Место волокна углерода электродом внимательно на предметное стекло с тефлоновой лентой.
2. Визуализируйте наконечник при вскрытии микроскопом.
3. Используйте чистую лезвие скальпеля, чтобы сократить перпендикулярно углеродного волокна оставить плоский чистую поверхность для размещения углеродного волокна от клеток.

Discussion

Этот протокол описывает, как создавать и сократить амперометрического электродов. Во время амперометрического записей, электрод из углеродного волокна помещают на поверхность секреторных клеток. Exocytotic активность наблюдается как амперометрического шипы, который показывает текущее электрохимической вызванных переносом электронов после окисления катехоламинов. С практикой решений и резки амперометрического электроды, уровень шума может быть значительно улучшилась за многие из имеющихся в продаже электродов.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C