Summary
이 프로토콜은 탄소 섬유 전극을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 전극은 이후 탄소 섬유 amperometry와 vesicles에서 카테 릴리스를 감지하는 데 사용됩니다.
Abstract
탄소 섬유 전극 amperometry 측정 단일 세포의 vesicles에서 카테 릴리스의 검출을위한 열쇠입니다. 여기, 우리는 낮은 잡음 (<0.5 PA) 전극을 생성하는 데 필요한 기술을 설명합니다. 기술은 이전의 연구 (1,2)에 의해 출판 설명에서 수정되었습니다. 전극은 탄소 섬유를 준비하고 섬유 대기음하는 필터와 진공을 사용하여 각각의 모세관에 개별적으로 그들을 스레딩에 의해 만들어집니다. 다음, 섬유와 모세관은 미세 뾰족한 끝 두 개의 반쪽 각을 만들고, 전극 풀러에 의해 가져온 것입니다. 전극은 에폭시 - 유리 밀봉을 만드는 경화제와 혼합 뜨거운 액체 에폭시에 담근 수 있습니다. 마지막으로, 전극은 에폭시를 치료하기 위해 오븐에 배치됩니다. 전극주의 처리들은 지속적으로 손상없이되는 것을 보장하기 위해 중요합니다. 이 프로토콜은 단일 세포에서 녹음 amperometric 전극을 조작하고 절단하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1 부 : 탄소 섬유 준비
- 모세관 피펫의 ~ 1.25은 X 길이 길이의 탄소 섬유의 번들 (우리가 7μm 직경을 사용) 잘라요.
- 비등하여 사이징을 제거 ~ 100 용기에 아세톤의 ML 30 분 이상 뜨거운, 끓는 아세톤에 섬유를 추가합니다.
- 따뜻한 아세톤에서 섬유를 제거하고, 신선한 아세톤의 50-100 ML과 깨끗한 비커로 전송할 수 있습니다.
- 오픈 150mm 페트리 접시에있는 번들을 배치하고 airdry 하룻밤에 의해 건조 섬유.
2 부 : 불타는 연마 유리 모세관 튜브
- 포셉와 함께 중앙에 튜브를 들고 약 flame.Rotate 튜브에 끝을 노출하여 (우리가 오랫동안 마이크로 혈소판 모세관 튜브, 외경 1.5mm, 내경 1.3mm, 7.5cm 사용) 각각의 모세관 발사 - 폴란드어 3 회 불꽃 동안.
- 튜브를 반전하고 다시 3 번 회전, 불꽃에 반대 끝을 놓으십시오.
- 유리 접시에 불을 광택 튜브를 삽입하고는 탄소 섬유로 가득 준비 때까지 오븐에 전송할 수 있습니다.
파트 3 : 모세관에 탄소 섬유를 스레딩
- 마카 외 의해 설명과 유사. (2008)와 Mundroff 및 와이트먼 (2002)는, 필터가있는 진공에 연결된 플라스틱 튜브를 사용하여 유리관에 섬유를 빨아.
- 튜브 섬유 밖의 scalpel.Leave ¼ 인치를 사용하여 섬유를 잘라.
부 4 : 전극 풀러에서 피펫 섬유 이겠지
- 전극 풀러 (우리가 Narishige 일본 모델 PP - 830를 사용)에 모세관을 장소와 장소에 모세관를 잡아 손잡이를 조이십시오.
- 두 최적의 풀러 설정에서 설정 내고 실행할 수있는 스위치를 조작.
- 피펫이 절반으로 뽑아되면, 가위를 사용하여 중앙에 노출된 광섬유를 절단하여 두 반쪽을 분리.
- 각 전극 절반을 제거하고 섬유만이 8분의 1 인치는 튜브의 외부 왼쪽되도록 가위로 유리 seal.Trim에게 섬유를 깰 수있는 튀어나온 섬유에서 가져옵니다.
- 반복 섬유 전극 행진 16에 대한 때까지 1-4 단계를 반복합니다.
제 5 부 : 에폭시 - 유리 인감 만들기
- 55 세트 뜨거운 접시에 에폭시의 미리 만들어진 나누어지는를 가열 ° C 퓸 후드 6 분.
- 에폭시 테이프를 사용하여 번들로, 랩에게 뽑아 전극 ~ 16 가열되는 동안.
- Epon 수지, 6 분 동안 가열 후, 뜨거운 Epon 수지 (14 %, W / V)에 0.7 g xof MPDA를 추가합니다. 믹스는 병을 소용돌이 치는하여.
- 에폭시 충분한 양의가 모세관 작용을 통해 유리 도움말을 입력합니다 20 초에 대한 뜨거운 에폭시 경화제의 플러스 solution.After에 전극의 묶음을 찍어.
- 슬롯이있는 종이에 번들, 장소의 전극을 취소하고 오븐에서 트레이를 장소는 100로 설정 ° F.
- 최소 48 시간 후, 에폭시와 함께 기입 밟았다 팁을 가지고, 각 전극을 검사 마분지 홀더에 장소를 백업하고 다시 하나 이상의 섬유, etc.After가 없었 해부 microscope.Discard 전극 아래의 각 전극을 검토 oven.Electrodes는 대개 제조 후 약 1 달 동안 좋다에.
파트 6 : 탄소 섬유를 절단
- 플레이스 탄소 섬유는 테플론 테이프 유리 슬라이드에 신중 전극.
- 해부 현미경 팁을 시각화.
- 세포에 대한 탄소 섬유의 배치에 대한 평면 깨끗한 표면을 떠날 수있는 탄소 섬유에 걸쳐 수직으로 잘라 깨끗한 메스 블레이드를 사용합니다.
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Discussion
이 프로토콜은 amperometric 전극을 생성하고 절단하는 방법을 설명합니다. amperometric 녹음하는 동안, 탄소 섬유 전극은 분비 세포의 표면에 대해 배치됩니다. Exocytotic 활동 catecholamines의 산화 후 전자의 양도로 인한 전기 전류를 나타냅니다 amperometric 스파이크로 관찰됩니다. 연습이 만들고 amperometric 전극을 가공으로 소음이 크게 상용 전극의 많은 이상 향상시킬 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는이 프로토콜은 원래 설계되었습니다 그의 실험실에서, 시카고 대학에서 박사 아론 P. 폭스 감사 및 프로토콜의 발전을 위해 윌리엄 로덴 (세인트 루이스 대학).
우리는 화이트홀 재단과 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 감사합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
