Summary
Questo protocollo descrive come generare elettrodi in fibra di carbonio. Gli elettrodi vengono successivamente utilizzate per rilevare rilascio di catecolamine dalle vescicole con amperometria in fibra di carbonio.
Abstract
Elettrodi in fibra di carbonio sono cruciali per la determinazione del rilascio di catecolamine dalle vescicole in singole cellule per le misure amperometria. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per generare rumore basso (<0,5 pA) elettrodi. Le tecniche sono stati modificati dalle descrizioni pubblicato dai ricercatori precedenti (1,2). Gli elettrodi sono fatti con la preparazione delle fibre di carbonio e filettatura individualmente in ciascun tubo capillare utilizzando un vuoto con un filtro per aspirare la fibra. Successivamente, il tubo capillare con la fibra è tirato da un elettrodo estrattore, la creazione di due metà, ognuna con una punta sottile. Gli elettrodi sono immersi in acqua calda, epossidico liquido mescolato con catalizzatore per creare un sigillo di vetro-resina epossidica. Infine, gli elettrodi sono posti in un forno per curare la resina epossidica. Attenta gestione degli elettrodi è fondamentale per garantire che siano fatte in modo coerente e senza danni. Questo protocollo mostra come fabbricare e tagliare elettrodi amperometrici per la registrazione da singole cellule.
Protocol
Parte 1: Preparazione fibra di carbonio
- Tagliare un fascio di fibre di carbonio (usiamo 7μm diametro) ad una lunghezza che è ~ 1,25 X la lunghezza della pipetta capillare.
- Rimuovere il dimensionamento ~ facendo bollire 100 ml di acetone in un contenitore e aggiungendo le fibre al caldo, acetone bollente per 30 minuti o più.
- Rimuovere fibre della acetone caldo, e trasferirli in un bicchiere pulito con 50-100 ml di acetone fresca.
- Fibre a secco ponendo il fascio su un piatto di 150 millimetri aperto Petri e airdry durante la notte.
Parte 2: Fuoco-lucidatura tubi di vetro capillare
- Fire-lucidare ogni tubo capillare (usiamo tubi capillari micro-ematocrito, 1,5 millimetri di diametro esterno, diametro interno 1,3 millimetri, 7,5 centimetri di lunghezza) tenendo il tubo in centro con una pinza e di esporre la fine della flame.Rotate il tubo stesso sul 3 volte, mentre nella fiamma.
- Invertire il tubo e l'estremità opposta nella fiamma, ancora con rotazione 3 volte.
- Mettere al fuoco lucidato tubi in un piatto di vetro e trasferimento in forno fino a quando non sono pronti per essere riempito con fibre di carbonio.
Parte 3: Threading una fibra di carbonio in un tubo capillare
- Simile alle descrizioni da Machado et al. (2008) e Mundroff e Wightman (2002), succhiare la fibra nel tubo di vetro con tubo di plastica collegato ad un vuoto con un filtro.
- Tagliare la fibra con un scalpel.Leave ¼ di pollice in fibra di tubo.
Parte 4: Tirare Pipettare-fibra in un elettrodo Puller
- Luogo tubo capillare nel estrattore elettrodo (usiamo Narishige Giappone Modello PP-830) e serrare le manopole di tenere il tubo capillare sul posto.
- Manipolare gli interruttori per eseguire due tira, insieme con le impostazioni ottimali estrattore.
- Una volta che la pipetta è tirato a metà, separare le due metà tagliando la fibra nuda al centro con le forbici.
- Rimuovere ogni metà degli elettrodi e tirare la fibra sporgente per rompere il seal.Trim la fibra di vetro con le forbici in modo che solo 1 / 8 pollici di fibra è lasciato al di fuori del tubo.
- Ripetere i passi 1-4 fino a circa 16 fibre elettrodi sono tirati.
Parte 5: Esecuzione di resina epossidica-Glass Seal
- Scaldare una pre-made aliquota di resina epossidica su un piatto caldo insieme a 55 ° C per 6 minuti in una cappa aspirante.
- Mentre la resina epossidica è il riscaldamento, avvolgere ~ 16 degli elettrodi tirato in un fascio utilizzando del nastro adesivo.
- Dopo la resina Epon viene riscaldata per 6 minuti, aggiungere 0,7 grammi XOF MPDA alla resina calda Epon (14% w / v). Mescolare agitando il flacone.
- Immergere il fascio di elettrodi in resina epossidica a caldo più solution.After indurente circa 20 secondi, una quantità sufficiente di resina epossidica entreranno le punte di vetro attraverso un'azione capillare.
- Annullare l', elettrodi posto pacco di cartone con su slot e posto questo vassoio in forno a 100 ° F.
- Dopo almeno 48 ore, esaminare ogni elettrodo sotto un elettrodi microscope.Discard dissezione che non si riempiono di resina epossidica, hanno una punta fracassato, avere più di una fibra, etc.After ispezionando ogni elettrodo, posto di nuovo sul supporto di cartone e ritorno nel oven.Electrodes sono generalmente buoni per circa 1 mese dopo la fabbricazione.
Parte 6: Taglio della fibra di carbonio
- In fibra di carbonio elettrodo posto attenzione su un vetrino con nastro di teflon.
- Visualizza la punta sotto un microscopio da dissezione.
- Utilizzare una lama pulita bisturi per tagliare perpendicolarmente attraverso la fibra di carbonio a lasciare una superficie piana pulita per il posizionamento della fibra di carbonio contro una cella.
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Discussion
Questo protocollo descrive come generare e tagliare elettrodi amperometrici. Durante le registrazioni amperometrica, un elettrodo di fibra di carbonio è posto contro la superficie di una cellula secretoria. Attività esocitotico si osserva come picchi amperometrico, che indica la corrente elettrochimica causata dal trasferimento di elettroni dopo l'ossidazione delle catecolamine. Con la pratica facendo e taglio elettrodi amperometrici, i livelli di rumore può essere notevolmente migliorato rispetto a molti degli elettrodi disponibili in commercio.
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Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Aaron P. Fox presso l'Università di Chicago, nel cui laboratorio di questo protocollo è stato originariamente progettato, e William Roden (Saint Louis University) per un ulteriore sviluppo del protocollo.
Ringraziamo la Fondazione Whitehall e National Science Foundation per il supporto.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
